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        胶原蛋白的分离

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        胶原蛋白是细胞外间质的主要成分,占人体总蛋白的1/3胶原蛋白具有广泛的生物活性,参与细胞增殖、运动、分化、以及肿瘤细胞的转移等病理过程。胶原提取物可作为某些特殊细胞培养的基质,模拟细胞的体内环境。胶原可以作为整形及美容的填充物材料,也可用于人造血管的预凝,在许多疾病的诊断与研究(肝硬化、肺纤维化、硬皮病等)中,胶原的提取及分析已成为必要的手段。
            目前已发现的胶原类型有13种,结构与功能较清楚的有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原。不同类型胶原在体内的分布不同。Ⅰ型胶原主要分布在筋腱、骨骼、牙齿和各种软组织器官中;Ⅱ型胶原主要在透明软骨和弹性软骨中;Ⅲ型胶原在各种软组织脏器内;与Ⅰ型胶原分布大致相同;Ⅳ型胶原在基膜里;Ⅴ型胶原在细胞外周。
            常用的胶原提取法为胃蛋白酶限制性降解法。在0.5mol/L乙酸中加入一定量的骨蛋白酶,于4℃作用于粉碎的组织,可将组织中的胶原蛋白提取出来,提取出的胶原,可按各型胶原析出的盐浓度不同而彼此分离。各种蛋白在酸性或中性的条件下被盐析沉淀所需的氯化钠的浓度。
        操作方法:
        所有操作需在0~4℃下进行。
        1.  取皮肤小心刮去毛发,剔去皮下脂肪及结缔组织。
        2.  丙酮中浸泡过夜,进一步去除残留脂肪,用冷 蒸馏 水清洗,除去丙酮。
        3.  将组织切碎,倒入少量0.5mol/L乙酸(pH2.5),用打碎机打制成匀浆,加入胃蛋白
        酶。酶量与湿组织量之比为1:100,再加入足量0.5mol/L乙酸,使溶液中酶的终浓度为2mg/ml。搅拌过夜。16,000r×45min离心,弃沉淀。
        4.  留上清。沉淀重复3步,弃去沉淀。将2次上清合并。
        5. 上清边搅拌边缓缓加入氯化钠粉末,使终浓度至0.7mol/L,放置过夜。16,000r×
        45min离心,弃上清。
        6. 沉淀用匀浆器匀浆,加0.5mol/L乙酸溶液,使溶液完全透明。
        7. 边搅拌边缓慢加入氯化钠,使终浓度为0.7mol/L,放置过夜。
        8. 16,000r×45min离心,弃上清。沉淀冷冻干燥,即得皮肤胶原制品。
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