植物细胞大规模培养技术

植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规模者可利用发酵罐生产。
植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。20世纪30年代，组织培养取得了飞速的发展，细胞在植物体外生长成为可能。1939年Gautheret，Nobercourt，White分别成功地培养了烟草、萝卜的细胞，至此，植物组织培养才真正开始。50年代，Talecke和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长在悬浮培养基中。自1956年Nic-kell和Routin第一个申请用植物组织细胞培养产生化学物质的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。随着生物技术的发展，细胞原生质体融合技术使植物细胞的人工培养技术进入了一个新的更高的发展阶段。借助于微生物细胞培养的先进技术，大量培养植物细胞的技术日趋完善，并接近或达到工业生产的规模。
植物细胞培养技术广泛用于农业、医药、食品、化妆品、香料等生产上，据报道，全美国的药方中四分之一是含有来源于植物的药品。尽管通过植物细胞培养可以获得许多产品，但总的来说分为两类：初级代谢产物(包括细胞本身为产物)和次级代谢产物。目前，细胞本身作为最终产物并不经济。大规模培养植物细胞主要用于生产次级代谢产物。有些产物通过化学方法合成很不经济；有些产物其唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物必须生长在热带或亚热带地区，还要受到其它自然条件(如干旱、疾病)和人为条件(如政策)的影响。最不能克服的是，有些植物从种植到收获要花几年时间，又根难选出高产植株，不能满足需要。因此，可以通过采用大规模植物细胞培养技术直接生产。例如，紫草宁(shikonvin)是典型的通过大规模培养植物细胞生产的产品。紫草宁既可作为染料又可入药，价值高达＄4500/kg，但是紫草(dithospermum)需要生长2~3年，其紫草宁浓度才达到干重的1%~2%，远不能满足需要。而通过大规模培养紫草宁可在短时间内（3周左右）大量生产紫草宁（干重的14%左右）。由此可见，植物细胞培养技术应用于大规模有价值产品的生产具有巨大潜力。
 
一、植物细胞培养基的组成和制备
1、细胞培养基的组成
确定植物细胞工业规模培养的培养基是个重要而复杂的问题。首先植物细胞培养基较微生物培养基复杂得多，且工业化培养基又不同于实验室用培养基，即便是工业化培养本身，甚至因培养目的及培养阶段不同而采用不同培养基。植物细胞大规模培养目的是生产细胞、初级代谢产物、次级代谢产物、疫苗或用于生物转化，迄今虽有几种已知成分培养基为人们普遍采用，但不同培养基培养结果不同。因此，需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。选择培养基的基本原则是培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜，但适宜于细胞生长的培养基，不一定适合于生产次生代谢产物及其它目的，通常需根据培养目标设计相应培养基，如需生产次生代谢产物时，除选用促进细胞生长培养基外，尚需提高次生代谢成为产率的培养基，待细胞生长至静止期时用以生产次生代谢产物。Morris在长春花细胞悬浮培养过程，对培养基进行组合研究并考察其蛇根碱、阿玛碱及其它生物碱产量的变化，发现细胞生长阶段和产物生产阶段采用不同培养基，各种产物均有不同程度增加，说明不同培养阶段必需采用不同培养基；又如锦紫苏悬浮细胞培养，首先从15种培养基种筛选出迷失香酸产率高的B ₅ 培养基，经试验又向其中添加2，4-二甲基苯氧乙酸作为激素，再用于培养锦紫苏细胞，产物生成量提高40%；又将蔗糖浓度由2%提高到7%，产物量又明显提高，且产物积累量可达到干细胞量13-15%；因此，在培养的不同阶段采用不同培养基以促进细胞生长及其它目的，是十分重要的。
无论培养目标设计是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。
(1)碳源  蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前二者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。
(2)有机氮源  通常采用的有机氮源有蛋白质水解物(包括酪蛋白质水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。
(3)无机盐类  对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中无机盐的浓度应在25mmol左右。硝酸盐浓度一般采用25～40mmol／L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20mmol／L，磷、镁、钙和硫元素的浓度在1～3mmol／L之间。
(4)植物生长激素  大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。激素分成两类既生长素和分裂素。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸和奈乙酸。分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤(BA)和玉米素(Z)。分裂素和生长素通常一起使用，促使细胞分裂、生长。其使用量在0.1～10mg／L之间，根据不同细胞株而异。
(5)有机酸  加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10mmol。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。
表14-3  常用植物细胞培养基的组成（mg/L）

成  分	培  养  基  种  类
M S	B 5	E 1	N 6	NN	L 2
MgSO 4 ·7H 2 O KH 2 PO 4 NaH 2 PO 4 ·H 2 O KNO 3 CaCl 2 ·H 2 O NH 4 NO 3 （NH 4 ） 2 SO 4 H 3 BO 3 MnSO 4 ·H 2 O Zn SO 4 ·7H 2 O NaMoO 4 ·2H 2 O CuSO 4 ·5H 2 O CoCl 2 ·6H 2 O KI FeSO 4 ·7H 2 O Na 2 -EDTA Na- Fe-EDTA 甘氨酸 蔗糖 维生素B1 维生素B5 烟酸 肌醇 pH值	370 170   1900 440 1650   6.2 15.6 8.6 0.25 0.025 0.025 0.83 27.8 37.5   2 30×10 3 0.5 0.5 0.5 100 5.8	250   150 2500 150   134 3.0 10.0 2.0 0.25 0.025 0.025 0.75     40.0   20×10 3 10.0 1.0 1.0 100 5.5	400 250   2100 450 600   3.0 10.0 2.0 0.25 0.025 0.025 0.8     40.0   25×10 3 10.0 1.0 1.0 250 5.5	185 400   2830 166   463 1.6 3.3 1.5 0.25 0.025   0.8 27.8 37.3   40 50×10 3 1.0 0.5 0.5   5.8	185 68   950 166 720   10.0 19.0 10.0 0.25 0.025 0.025       100 5 20×10 3 0.5 0.5 5.0 100 5.5	435 325 85 2100 600 1000   5.0 15.0 5.0 0.4 0.1 0.1 1.0     25.0   25×10 3 2.0 0.5   250 5.8

(6)复合物质  通常作为细胞的生长调节剂如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是1～15mmol／L。
目前应用最广泛的基础培养基主要有M _S 、B ₅ 、E ₁ 、N ₆ 、NN和L ₂ 等（表14-3）。