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        姐妹染色单体互换标本制备法

        互联网

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        一、实验目的
        通过实验,掌握姐妹染色单体分染技术。
        二、实验原理
        姐妹染色单体交换是近年来细胞遗传学研究的一个新方法。其原理是,当细胞接触到5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)时,Brdu可作为核苷酸前体物,专一替代胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA链中。只要通过两个细胞复制周期,就可使姐妹染色单体中的一条单体的DNA双链中,有一股链是掺入有Brdu的,而另一条单体的DNA双链中,两股链全掺入有Brdu.这样的细胞经过分化染色处理,即可见到同一条染色体的两条姐妹染色单体有明显的差异,有一条单体为深色,另一条为浅色。
        三、实验材料
        体重为20~30克左右的纯小白鼠,蚕豆种子。
        四、实验器具和药品 试剂
        显微镜、冰箱、水浴锅、天平、离心机、剪刀、镊子、注射器、吸管、离心管、载片、量筒、烧杯、紫外灯、大培养皿。
        秋水仙素 、5-溴脱氧尿苷、液体石蜡、柠檬酸钠、氯化钾、2×SSC溶液、磷酸缓冲液、盐酸、Giemsa 原液。
        五、实验方法和步骤
        (一)动物实验法
        1.称100mg Brdu用5ml液体石蜡在小烧杯内混匀,冰箱保存备用。
        2.用2ml注射器(8号针头)吸取药液,按每克体重注射1mg的量注入小鼠右腋皮下或腹腔内。
        3.注射56小时后,按5ug/克的量注射秋水仙素溶液。
        4.4小时后处死动物,取出大腿骨和胫骨。
        5.按“小白鼠染色体的制备与观察”实验的方法制备染色体标本。
        6.将染色体标本放入37℃温箱内处理24小时。
        7.在恒温水浴锅(48℃)内放一大培养皿,把标本片分放在皿内,上复一张擦镜纸,滴加适量的2×SSC溶液,用15W紫外灯照射30分钟,灯管距离标本片约6厘米。
        8.照射完毕以蒸馏水或磷酸缓冲液冲去标本上的2×SSC溶液。
        9.用3%Giemsa 染液染色10分钟。
        10.清水冲洗,片干后镜检。
        (二)植物实验法
        1.选取当年的蚕豆种子,经水泡胀后,转入20℃温箱培养。 当主根长至3cm时,剪去根尖生长点,以利于长出更多的侧根。
        2.当大多数侧根长至0.5cm时,用盛有5×10-4M Brdu溶液的小瓶,继续在20℃黑暗条件下处理侧根24~36小时。
        3.切取侧根根尖(0.5cm)浸入0.05%的秋水仙素溶液中预处理3.5~4小时。
        4.用卡诺氏液固定3~24小时。
        5.将根尖放在1N HCL 60℃条件下水解10分钟。
        6.经水洗后用席夫 试剂 染色30分钟。
        7.取一着色的根尖,放在载片上,加一滴45%醋酸,盖上盖片,用镊子或橡皮头铅笔将材料敲呈一薄雾状。
        8.选择分散的中期分裂相细胞,在高倍镜下可看到姐妹染色单体间呈现明显的深浅差别。深染的是BB-染色单体,浅染的是BT-染色单体。部分染色体上出现姐妹染色单体互换。凡染色单体端部出现的交换计为1个SCE,中部出现的计为两个SCE。
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