方案22.5 姐妹染色单体交换实验（诱变实验）

用胰蛋白酶消化 BUdR 标记了的两个细胞周期并停留在分裂中期的细胞，在低张缓冲液中孵育细胞，然后固定。用 Hoechst 33258 处理细胞后制备载有细胞的载玻片，光降解染色体。用姬姆萨进行染色体染色，在光学显微镜的油镜下进行观察。

一、材料

无菌

D-PBSA
PE:10 mmol/L EDTA (溶于 PBSA)
胰蛋白酶：0.12% (溶于 PE)
BUdR(Sigma): 用无菌纯水制备 1 mmol/L 储备液
Karyomax: 秋水仙酰胺，10ug/ml (Invitrogen)
培养基

非灭菌

2 x SSC: 将 20 x SSC 1:10 稀释
低张缓冲液：0.075mol/LKCl
Sorensen’s 缓冲液：磷酸缓冲液，0.066 mol/L , pH 6.8 (Merck 的小袋)
甲醇：乙酸（3:1)，置于冰上，新鲜配制
姬姆萨溶液，0.76 %：将 lg 姬姆萨粉末（Merck) 置于 66 ml 甘油中，56～60℃ 水浴 1.5～2 h ，待溶液冷却后，加人 66 ml 无水乙醇
姬姆萨：用 Sorensen’s 缓冲液稀释到 3.5%, pH 6.8
Hoechst33258 (Sigma)：20ug/ml (溶于超纯水）
乳胶照相封固剂或黏合剂
二甲苯
DPX 封胶（Merk )
22 cm X15 mm 盖玻片
科普林缸
载玻片（ ThermoElectron )
短波紫外灯及照射盒

安全提示 :

Hoechst 33258 具有致癌性，要在通风橱中称量与溶解。

二、操作步骤

预处理

1. 以适当密度（如 75 cm² 培养瓶中接种 1X10⁶ 细胞）接种细胞，37℃ 孵育 2 天。

2. 将 BUdR 加入培养基，终浓度为 10umol/L 。

3. 将细胞继续在 37℃ 避光孵育 48 h (约 2 个细胞周期）。

4. 依据细胞周期时间的不同，在收获前 1～6 h 加人秋水仙酰胺。对于人细胞系，秋水仙酰胺的终浓度应为 0.01ug/ml。

收获细胞

5. 用 D-PBSA 清洗细胞，用 PE 配制的 0.12% 胰蛋白酶 lml 消化细胞。

6. 用 10 ml 培养基重悬细胞，将细胞悬液移至 50 ml 离心管中。

7.1200 g 离心 5 min 。

8. 吸去上清，在沉淀上方留下约 1.2 ml 上清。以手指轻弹管壁，重悬沉淀。

9. 缓慢加入 10 ml 低张缓冲液（预热至 37℃)，室温孵育细胞悬液 10～15 min 。

10. 用台式离心机 1200 g 离心 5 min 。

11. 吸去上清，在沉淀上方留下约 1.2 m l 上清。轻弹管壁，重悬沉淀。

12. 加入 10 ml 冰冷的固定液，最初逐滴加人，每加入一滴都要充分混匀。冰上放置 10 min。

13. 重复第 10～12 步，将细胞留在固定液中 4℃ 过夜，以改善制片效果。

14. 将固定的细胞 1200 g 离心 5 min ，用 3～5 ml 甲醇/乙酸重悬细胞。

15. 将细胞储于一 20℃。

制片效果

16. 载玻片应保证洁净并没有油脂，因此使用前用无水乙醇擦一擦。

17. 用一根短的巴斯德玻璃吸管，吸取约 500ul 固定过的细胞。

18. 拿住载玻片，使其斜向下方。手持巴斯德吸管，在载玻片上方至少 15 cm 处，滴 3 滴细胞悬液在玻片上（见方案 16. 7)。

19. 避光，空气中晾干载玻片。

20. 在相差显微镜下检査载玻片，确保载玻片上中期细胞分布均匀，并且染色体分散良好。

花斑染色

21. 将载玻片浸人盛有 20ug/ml Hoechst 33258 的科普林缸中，放置 10 min(Hoechst 有毒性，操作时要戴手套）

。
22. 将载玻片转移到玻片架上，每片上滴 500ul 2XSSC。

23. 将 22 mm x 50 mm 盖玻片盖在载玻片上，周围用暂时性的黏合剂封上，以防蒸发。

24. 将载玻片放在玻片架上，盖玻片朝下，将玻片架放入短波紫外盒载玻片与紫外光源之间保持大

约 4 cm 的距离。载玻片在紫外光下暴露的时间越长，形成的浅色染色体也就越浅。将载玻片暴露在紫外光下约 25～60 min。

25. 将载玻片上的盖玻片拿开，用超纯水清洗载玻片 3 次，每次 5 min。用铝箔包裹玻片架。

26. 避光，空气中晾干载玻片。

27. 将载玻片放入盛有 3.5% 姬姆萨溶液（用 Sorensen 缓冲液配制，pH 6.8) 的科普林缸中，染色 3～5 min 。

28. 用自来水小心漂洗载玻片，用吸水纸吸去水分。

29. 将载玻片在实验台上放置 1 h ，晾干。把载玻片在二甲苯中浸一下，每张载玻片上滴 4 滴 DPX 封胶（Merk )，将一张 22 mmX50 mm 盖玻片缓慢放下，用吸水纸将气泡排出（最后一步要在通风橱中进行操作，因为二甲苯的气雾有毒，另外也要戴手套）。

30. 载玻片放在通风橱中过夜，晾干 

分析

31. 在 40X 物镜的光学显微镜下，筛选出有中期分散染色体的载玻片。

32. 载玻片上找出一个中期分散染色体分布最多的区域，然后在油镜下观测。

33. 如果没有姐妹染色单体交换 （SCE) 发生，那么每条染色体都有一个连续染色的浅色染色单体以及一条连续染色的深色染色体。如果一条染色单体上有一深染区，然后是一浅染区，那么其姐妹染色单体 上就为一浅染区，然后是一深染区，这样就表示发生了一处姐妹染色单体交换 。一个在染色上不连续的点计做是一个姐妹染色单体交换。

34. 对每个细胞内的姐妹染色单体交换的数目以及每个细胞内的染色体数进行计数。

35. 大型染色体的姐妹染色单体交换的数目通常比小型染色体的要多。此外，不同细胞的姐妹染色单体交换的发生率也有所不同，因而，对每条染色体的姐妹染色单体交换进行评分是测定姐妹染色单体交换速率的一种更准确的方法。姐妹染色单体交换分数按以下公式计算：

对于每个要研究的细胞系力求要对大约50个分散的分裂相进行计分。