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        125I标记单克隆抗体技术

        互联网

        1203

        同位素标记是一种重要的抗体标记技术,牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外,还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。

        (一) 原理

        氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠,在水溶液中生成次氯酸,为一种温和氧化剂,当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中,可将I2氧化为I+并结合到氨基酸上。如标记条件温和,标记后的McAb仍具有良好的结合活性,通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。

        (二) 方法

              在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg/100μl,
              再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液
              再加入10μl(含1mCi) 125 I

        ↓

              加入10μl氯胺-T(5mg/ml溶于0.05M
              磷酸盐缓冲液),孵育时间不超过30秒

        ↓

              加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg/ml溶于
              0.05M磷酸缓冲液)

        ↓

              加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M
              磷酸缓冲液+4%牛血清白蛋白)

        ↓

              用PD10柱(Sephadex G25)除去游离 125 I
              用4%BSA PBS洗脱

        ↓

        分部收集,0.5ml/管

        每管取5μl进行γ计数,计算标记抗体的比活性和标记率

                   结合于McAb125I放射性强度(cpm)
            标记率(%)=───────────────────
                      总放射性强度(cpm)

                        结合于某一管McAb上的放射性强度
            比活性(μCi/μgMcAb)=────────────────
                            某一管McAb总量

          (三) 试剂器材  免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

        1. 纯化后的McAb

        2. 0.05M磷酸缓冲液,氯胺桾,偏重亚硫酸钠,KI,BSA

          3.  125 I

        4. 有通风装置的超净台,γ计数仪

        5. PD10柱(Sephadex G25)

        (四) 注意事项

          1. 严防同位素污染,工作人员必须穿着工作衣,戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用 125 I和标记物应妥善保管。

          2. 如标记细胞因子、激素等,应选用更温和的标记方法,使保持更好的 生物 学活性。

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