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        用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用

        互联网

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        【基本原理】
        转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的谷丙转氨酶(Glutamic Pyruvic Transaminase ,GPT)活性较高,它催化如下反应:
        α—酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸
        本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。
        纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,能吸收20~22 %的水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合,在一般情况下很难脱去,而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相,以有机溶剂作为流动相。在用纸层析法分离氨基酸时,由于各种氨基酸在此二相中的分配系数不同,各有一定的迁移率。极性弱的氨基酸,易溶于有机溶剂即分配系数小,随流动相移动较快,Rf值大;而极性强的氨基酸相反,据此可以分离鉴定氨基酸。
        本实验用圆滤纸进行水平型层析,除待测液外,点加对照液和标准液,层析后用茚三酮法显色,对此观察色斑,判定结果。
        【器材】
        玻璃匀浆器、离心管、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、10cm圆滤纸、吹风机、手术剪刀。
        【 试剂 】
        1.0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
        2.0.2mol/L Na 2 HPO 4 溶液81ml与0.2mol/L NaH 2 PO 4 溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
        3.0.1mol/L丙氨酸溶液
        称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。
        4. 0.1mol/Lα-酮戊二酸
        称取α-酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
        5.0.1mol/L 谷氨酸溶液
        称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。
        6.0.5%茚三酮溶液
        称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。
        7.层析溶剂
        酚:水= 4:1(V/V)混匀备用。现用现配。
        【基本操作】
        1.匀浆制备:取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆,用上述缓冲液3.5ml混匀备用。
        2.酶促反应过程
        (1)取 离心管 两支,编号:1(测定管)、2(对照管),各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热5分钟,取出冷却。
        (2)各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。
        (3)37℃保温,1小时后取出。

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