基因工程综合实验操作

　
大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固体培养基中，置于37℃
培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养
基中加入100 μg/ml的氨苄青霉素。在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯
-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40 μg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50μg/ml。
　
大肠杆菌染色体DNA的抽提
　
1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。
2. 沉淀中加入3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。
3. 加入400 μl 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。
4. 加入10 μl 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60℃保温60分钟。
5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。
6. 4℃，15 000 rpm，离心30min。
7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000 rpm，离心30分钟。
8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4℃，离心10分钟。
9. 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后 -20℃放置30分钟以上，4℃，15000 rpm，离心30分钟。
10. 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心5分钟。
11. 弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。
12. 取5μl电泳。

Buffer A	Tris-HCl (pH8.0)	10 mM
EDTA	(pH8.0)	20 mM

DNA酶切


在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系：置于37℃保温1.5小时，然后电泳检查

质粒DNA	限制性内切酶	10×酶切缓冲液	无菌重蒸水	总体积
5 μl	1 μl	1.5 μl	8.5 μl	15 μl

DNA琼脂糖凝胶电泳

　
1. 用1×TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。
2. 待溶液冷却至60℃左右，加入溴化乙锭（用水配1 mg/ml贮存液）至最终浓度为0.5μg/ml，充分混匀。
3. 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度
在3-5 mm之间。
4. 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE-buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使
缓冲液没过胶面约1 mm。
5. DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。
6. 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。采用100V电压进行电泳。
7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。
　

50×TAE-buffer	Tris	242 g/l
	冰醋酸	57.1 ml/l
EDTA	0.4 g/l