非变性条件下GFP的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

[实验原理]
制备电泳与普通的分析电泳在原理上没有什么不同，只是用的凝胶厚些、加的样品量大些罢了。因为制备电泳的胶厚，电泳时有个散热问题，电泳后还有把所要分离的蛋白从胶中洗脱下来的问题。为了提高制备电泳的效率，有些公司（如BIO-RAD）生产了专为制备电泳设计的电泳槽。我们的实验用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备GFP，在整个的电泳过程中GFP始终维持其天然活性。电泳结束后，不用染色处理，在紫光照射下可以很容易地将发绿色荧光的GFP条带从凝胶上切下来。

[实验操作]

1、用1.5毫米夹条的玻璃板做胶，分离胶的浓度仍为12%，注意用不含SDS的非变性系统缓冲液配胶，配浓缩胶时也同样。

2、做浓缩胶时不加梳子，而是做分离胶那样用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面。

3、制备电泳的蛋白样品与前次免疫印迹的相同，用非变性的样品缓冲液做样，样品不加热处理。上样前要充分离心(1.5mL 离心管 ，12000rpm，5分钟），勿使所加样品中含有沉淀。

4、上样量0.2-0.4mL，上样后要使样品的高度在整个浓缩胶面上均匀分布。

5、在样品完全走进浓缩胶前电流不要调得过大，以免样品发热，产生明显的对流。待样品完全走进浓缩胶后可以加高电压，但不要超过150V，以防过热。

6、电泳结束后，取下并打开玻璃板“三明治”，在紫光灯下用刀片将发绿色荧光的条带从胶上切下，切成小段，放于干净的1.5mL 离心管 中，冷冻保存。