SPA提取IgG

(一) 原理
将SPA偶联至Sepharose－4B上后，利用亲和层析来提取人和某些动物的IgG，这样可以省去制备第二抗体。该法特别适用于单克隆抗体的研究。该法提取IgG与利用IgG纯化SPA原理是一致的。

(二) 材料与 试剂
1．Sepharose－4B琼脂糖
2．SPA
3．溴化氰
4．0.10Mol/L NaHCO ₃ 液
5．pH3.2盐酸－甘氨酸液
6．生理盐水
7．待提取的IgG样品
8．层析柱(2cm×10cm)
9．磁力 搅拌器
10．751分光光度计

(三) 操作方法
1．Sepharose－SPA的制备 在50ml三角烧瓶中加入 蒸馏 水20ml，加入固体溴化氰1.4g，加盖后温和振荡，使之溶解。倒入已盛有 琼脂 糖珠(4B)的烧杯中，立即搅拌，并滴加2mol/L NaOH溶液，边加边搅拌，使pH维持在11。反应6min后，倒入布氏漏斗，迅速以预冷的0.1mol/L NaHCO ₃ 溶液500ml抽滤洗涤已活化的 琼脂 糖珠。洗涤时间不超过90Sec，立即将此琼脂糖珠加入预先以0.1mol/L NaHCO ₃ 平衡的SPA液10ml中(10mg/ml)，于4℃搅拌16h～20h，此即为Sepharose－SPA的吸附剂。
2．将Sepharose－SPA低速离心5min，以生理盐水洗涤2－3次，除去未偶联上的SPA，然后装入2cm×10cm层析柱中，用生理盐水200ml洗至洗液OD ₂₈₀ nm＜0.02。
3．亲和层析 将欲提取的IgG样品用生理盐水做1:5稀释后，加入Sepharose－SPA层析柱，以生理盐水洗脱，流速20ml/h。IgG被柱上的SPA吸附住，其它蛋白质随洗脱液流出。以生理盐水洗至洗脱液的OD ₂₈₀ nm＜0.02为止。
4．解吸附 以pH2.0盐水－甘氨酸 缓冲液 进行洗脱，将洗脱下来的蛋白液迅速以1mol/L的NaHCO ₃ 液中和至pH 7.0，此即为提纯的IgG。
5．将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度后，浓缩、分装、低温保存备用。
6．Sepharose－4B－SPA柱复生 采用7mol/L尿素洗柱后，再用生理盐水洗涤，最后用PBS液平衡后，可重复使用。

（四）结果判定
1．IgG的收集量。
2．IgG的纯度鉴定 可采用圆盘电泳或免疫电泳进行鉴定。
3．IgG的活性鉴定 可采用抗该IgG的ELISA试验，以鉴定IgG的活性。