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        Northern Blot实验方法

        互联网

        1558
         

        [ 仪器 、试剂、材料]
        (一) 仪器
        恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV 交联仪,杂交炉,恒温摇床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电炉(或微波炉),离心管,烧杯,量筒,三角瓶,等。
        (二)材料
        总RNA样品或mRNA样品,探针模板DNA(25 ng),尼龙膜
        (三) 试剂
        NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),琼脂糖,DEPC, X光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,双氧水, 灭菌水等。

        [方法与步骤]
        1. 用具的准备:
        180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
        电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。
        处理DEPC水(2 L)备用。

        2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
        用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。

        3.制胶:
        1. 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)
        2. 在通风厨中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。
        注意尽量避免产生气泡。
        3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子
        如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。
        4.胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的buffer。)
        5.检查点样孔。

        4. RNA样品的制备
        在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。

        5. 电泳:
        1. 将RNA样品小心加到点样孔中。
        2. 在5V/cm下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中,每隔30min短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。
        3. 紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。
        注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

        6. 转膜
        1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用DEPC水冲洗。
        2.用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用DEPC水冲洗二次。
        3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。
        4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。
        5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约2mm,以防止漏气。
        6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。
        7.打开真空泵,使压强维持在50~58mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。
        8.转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒,去除残余的胶和盐。
        9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。
        10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
        12.将膜在-20℃保存。

         

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