人基因组DNA的提取

一、实验目的
掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。

二、实验原理
从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持DNA分子的完整。
在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。

三、实验用品和材料
（一） 试剂
    1．抗凝剂：EDTA 2%（W／V）生理盐水抗凝剂。称取2g EDTANa2、0．85g NaC1，加双蒸水至100m1。1ml该 试剂 可抗10ml全血凝结；亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。
    2．15mmo1／L Tris-HCl（pH8.0），15 mmo1／L EDTA（pH8.0），15 mmo1／L NaCl （简称TES溶液）；用lmo1／L Tris-HCl（pH8.0），0.5 mmo1／L EDTA（pH8.0），3mo1／L NaCl稀释成15 mmo1／L TES溶液。
    3．10%（W／V）SDS。
    4．15mmo1／L TES饱和酚，重蒸酚在热水浴（100℃）中溶化后加入1/3体积的15 mmo1／L TES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6h以上。酚层在下，水层在上。吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮，可加少量8-羟基喹啉（2 mmo1／L～5mmo1／L）。
    5．氯仿／异戊醇（24：1，V/V），现配现用。
    6．蛋白酶K。
    7．10mmo1／L Tris-HCl，1mmo1／L EDTA（pH7.5）（简称TE溶液）。用1mo1／L Tris-HCl（pH7．5），0．5mo1／L EDTA（pH 7．5～8．0）稀释配制。
（二）用品：Eppendorf试管、 离心管 、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。

四、实验方法和步骤
1．白细胞的分离
    （1）抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。
    （2）在50ml 离心管 中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。
    （3）室温以2000rpm离心15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。
    （4）吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。
    （5）用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。
    （6）最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。