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        从酵母中大规模自然亲和纯化溶解膜蛋白

        互联网

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        一、材料与方法
        1.  EDTA(无蛋白酶抑制剂)(Roche)
         
        2.  毛地黄皂苷(EMDChemicals)
         
        3.  蛋白酶抑制剂(DMSO,leupeptin,pepstatin)(Sigma)
         
        4.  BECKMAN离心管(BECKMAN)
         
        5.  ANTI-FlagM2亲和树脂(Sigma)
         
        6.  3×FLAG肽(Sigma)
         
        二、设备
        1.  AvestinEmulsiflexC3匀浆器(Avestin)
         
        2.  BECKMAN离心机,转子,聚碳酸酯离心管(BECKMAN)
         
        三、步骤
        1.  细胞裂解物的制备
        (1)收集4 000 OD细胞,OD600在1左右,集菌4升,5 000 rpm,20分钟。每管用100 ml 水洗一次,转移到50 ml 离心管。如果必要在-80℃冻存。
         
        (2)用50 ml 预冷的溶解缓冲液(加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,不加DTT)悬浮细胞,最终为2个50 ml 的样品。
         
        (3)用AvestinEmulsiflexC3匀浆仪破碎细胞。
         
        (4)离心去掉未裂解的细胞,1 000 g 离心2次到3次。
         
        (5)将上清转移到Beckman聚碳酸酯离心管,44 000 g 高速离心,30分钟。
         
        (6)用0.5 ml 溶解缓冲液将微粒体重悬,加14 ml 含2%毛地黄皂苷的免疫沉淀缓冲液(加蛋白酶抑制剂)(溶解缓冲液-山梨醇+15%甘油)。
         
        (7)用nutatinglysate于4度溶解膜蛋白1.5小时,44 000 g 离心30分钟,去除不可溶物质。
         
        2.  FLAG融合蛋白免疫沉淀
        (1)每个反应加300 μl 树脂悬液。
         
        (2)充分悬浮ANTI-FLAGM2亲和树脂,转移到15 ml 离心管。
         
        (3)400 g 离心树脂1 min,移除上清。
         
        (4)用5 ml 的4×免疫沉淀缓冲液(加0.1%毛地黄皂苷)洗树脂。
         
        (5)取15 ml 细胞裂解物,加ANTI-FLAG树脂,免疫沉淀3小时或者4℃过夜。
         
        (6)用10 ml 的4×免疫沉淀缓冲液(加0.1%毛地黄皂苷)洗树脂,将树脂转移到1.5 ml 离心管。
         
        3.  FLAG融合蛋白的洗脱
        用3×FLAG肽洗脱。
        (1)制备3×FLAG洗脱缓冲液:加150 μl 1×免疫沉淀缓冲液,0.25%毛地黄皂苷,1 μg/μl 3×FLAG。
         
        (2)向树脂中加150 μl 3×FLAG洗脱液。
         
        (3)4度轻晃30分钟。
         
        (4)400~1 000× g 离心1分钟,将上清移到新的离心管。
         
        (5)再向树脂中加150 μl 3×FLAG洗脱液,重复洗涤1次,合并洗脱后溶液。
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