表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

一、原理

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备

1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH₂O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl（pH8.0）：Tris 18.17g加ddH₂O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100ml。

3、1M Tris-HCl（pH6.8）：Tris 12.11g加ddH₂O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。

4、10%SDS：电泳级SDS10.0 g加ddH₂O 68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100ml。

5、10´电泳缓冲液（pH 8.3）：Tris 3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH₂O，定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH₂O至10ml。

7、2´SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl （pH6.8）2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH₂O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH₂O225ml。

9、脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH₂O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤

采用垂直式电泳槽装置

（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制

1、分离胶（10%）的配制：

ddH₂O 4.0ml
　　30%储备胶3.3ml
　　1.5M Tris-HCl 2.5ml
　　10% SDS  0.1ml
　　10% AP 0.1ml

取1ml上述混合液,加TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）10μl封底，余加TEMED 4μl ，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30～60min）

2、积层胶（4%）的配制：

ddH₂O1.4 ml
　　30%储备胶 0.33 ml
　　1M Tris-HCl  0.25 ml
　　10%SDS 0.02 ml
　　10%AP 0.02 ml
　　TEMED 2 μl

将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min。

（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

（三）上样：取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

（四）  电泳：在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V，分离胶电压100V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。

（五）染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6hr。

（六）脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

（七）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

三、注意事项

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。