微量补体结合反应（以钩端螺旋体病为例）
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本试验采取热法血清稀释法。每滴相当于0.02ml，总量为6滴，相当于0.12ml。
一、材料
1、抗原 系各型菌株培养物多价抗原，按瓶签说明倍数稀释；
2、溶血素 正式试验时使用2个工作单位；
3、补体系冻干补体 用灭菌生理盐水作1:5基础稀释。在溶血素效价测定和补体效价滴定时均作1:60稀释，在正式试验时，用2个工作单位；
4、1％的红血球悬液 用灭菌生理盐水洗涤与配制。在使用时与等量含2个工作单位的溶血素液配成致敏红血球悬液；
5、阳性血清 正式试验时1:100稀释；
6、阴性血清 正式试验时1:10稀释；
7、生理盐水。
二、预实验
1、溶血素效价测定 用小试管做时，单位为ml；用血清稀释板做时，单位为滴。
（1）溶血素稀释
先将溶血素做1:1000基础稀释。见表1。
| 稀释度 | 1：1000 | 1：2000 | 1：3000 | 1：4000 | 1：5000 | 1：6000 | 1：7000 | 1：8000 |
|
生理盐水 |
—— | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 1：1000溶血素 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
（2）溶血素效价测定
见表2。
| 1：1000 | 1：2000 | 1：3000 | 1：4000 | 1：5000 | 1：6000 | 1：7000 | 1：8000 | |
| 溶血素 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1：60补体 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 生理盐水 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 1%红血球悬液 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 置微型振荡器震荡3-5min后，放37℃水浴10min | ||||||||
| 溶血程度举例 | # | # | # | # | # | ＋＋＋ | ＋ | － |
根据上述结果,溶血素效价为1:5000即为一个工作单位，2个工作单位溶血素为1:2500稀释度。
2、补体效价测定
（1）补体稀释
见表3。
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1：60补体 | 0.05 | 0.08 | 0.10 | 0.12 | 0.14 | 0.16 | 0.05 | 0.08 | 0.1 | 0.12 | 0.14 | 0.16 |
| 生理盐水 | 0.25 | 0.22 | 0.20 | 0.18 | 0.16 | 0.14 | 0.25 | 0.22 | 0.20 | 0.18 | 0.16 | 0.14 |
（2）补体效价测定
见表4。
| 补体 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 抗原 | — | — | — | — | — | — | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 生理盐水 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | — | — | — | — | — | — |
| 置微型振荡器3-5min后，放入37℃水浴10min | ||||||||||||
| 1%致敏红血球 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 震荡3-5min后放入37℃水浴10min | ||||||||||||
| 溶血程度（举例） | － | + | ＋＋ | # | # | # | － | ＋ | ＋＋ | # | # | # |
以2个单位补体稀释度计算。按上表所示，在两列中达到完全溶血（＃）时，最小补体量1:60稀释为0.12ml，（即为第四管与第八管）做为1个补体单位。在抗原效价测定和正式试验时，使用补体0.20ml中应含2个单位补体。所以补体的稀释度应为：60:（0.12×2）＝x:0.20,x=50,即取1ml补体原液加49ml生理盐水即成。
3、抗原效价测定 新生产的抗原可按瓶签说明效价用，贮藏过久的抗原，应作效价测定后使用。
（1）抗原稀释
用血清稀释板做，见表5。
（2）抗原效价测定
见表6。
| 抗原稀释度 | 1：2 | 1：4 | 1：8 | 1：16 | 1：32 | 1：64 | 1：128 | 对照 | |
| 抗原 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | — | |
|
阳性血清 |
1：10 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1：100 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | — | |
| 2单位补体 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |
| 生理盐水 | — | — | — | — | — | — | — | 2 | |
| 震荡3-5min，37℃水浴min | |||||||||
| 1%致敏红血球 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |
| 振荡3～5min，37℃水浴10min，判定结果 |
（3）抗原效价测定（例）
见表7。
| 抗原稀释度 | 1：2 | 1：4 | 1：8 | 1：16 | 1： 32 | 1： 64 | 1： 128 | 对照 | |
| 阳性血清 | 1：10 | # | # | # | # | # | +++ | + | |
| 1：100 | # | # | # | # | # | # | — | ||
| 阴性血清 | — | — | — | — | — | — | — | ||
| 生理盐水 | — | — | — | — | — | — | — |
以抗原的最高稀释度与最高稀释度的阳性血清呈完全抑制溶血者，作为抗原效价。
按表7，抗原效价为1:32，即在使用时将抗原以生理盐水作1:32倍稀释。阴性血清对照应完全溶血。抗原抗补体对照应不超过1:2稀释度，为合格。
三、本实验
见表8。
| 孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 被检血清 | 阳性 血清 |
阴性 血清 |
抗原抗补体 对照 |
被检血清 抗补体对照 |
阳性血清 抗补体对照 |
阴性血清 抗补体对照 |
|||
| 血清 | 1：10 | 1：20 | 1：100 | 1：10 | 1：10 | 1：10 | 1：20 | 1：100 | 1：19 |
| 抗原 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | — | — | — | — |
| 2U补体 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 生理盐水 | — | — | — | — | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 震荡3-5min，37℃水浴10min | |||||||||
| 1%致敏红血球 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 震荡3-5min，37℃水浴10min | |||||||||
| 抑制溶血程度 | # | # | # | — | — | — | — | — | ± |
四、注意事项
1、结果判定时，完全透明为100％溶血（＃），混浊为50％溶血（++）时，判定以后者标准为依据。
2、抗原效价低于1:4时，不可使用。阳性血清效价低于1:100（抑制溶血程度＃）者，不能用于抗原效价测定。但若抑制程度在++以上者，尚可供正式试验时阳性血清对照用。
3、V型血清板较U型血清板反应观察清晰。
4、由于血清板传热性能较差，所以感作时间应适当延长。一般以阴性血清对照孔完全溶血为止。
