经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例）
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一、预备试验
1、绵羊红细胞悬浮液的制备 通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。亦可用阿氏液保存血液，阿氏液配方如下：
| 葡萄糖 | 24.60g |
| 氯化钠 | 5.04g |
| 柠檬酸钠（含2个分子结晶水） | 9.60g |
| 蒸馏水 | 1200ml |
溶液配好后，高压（10磅）灭菌10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内，将绵羊血直接采入瓶内，血量应大致与阿氏液量相等。摇匀，置冰箱中保存，可保存3周左右。
用时将血液移入离心管内，加3～5倍量生理盐水，离心沉淀洗涤三次，每次2000r／min，离心10min，然后去掉上清液，血球泥用生理盐水配成2.50％液应用。
2、溶血素效价测定 溶血素是用绵羊红细胞，经多次免疫家兔，抽取家兔血清，加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素可从生物制品厂购买。
溶血素效价测定的方法：先将溶血素稀释成100倍，即0.20ml的溶血素（溶血素实量含0.10ml）加入9.80ml生理盐水混合即可。然后按表1配成稀释液：
| 稀释倍数 | 1000 | 1200 | 1500 | 1800 | 2000 | 2500 | 3000 | 3500 | 4000 |
| 1：100溶血素 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| 生理盐水 | 0.90 | 1.10 | 1.40 | 1.70 | 1.90 | 2.40 | 2.90 | 3.40 | 3.90 |
| 全量 | 1.00 | 1.20 | 1.50 | 1.80 | 2.00 | 2.50 | 3.00 | 3.50 | 4.00 |
另取小反应管一列，按次序从每一稀释液取0.50ml分别加入各管中，添加时应由稀释度大的稀释液加起，这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水1.00ml，1︰20补体和2.50％红细胞悬液各0.50ml。在37℃水浴槽中放20min后判定结果。详细造作程序见表2。
| 稀释倍数 | 1000 | 1200 | 1500 | 1800 | 2000 | 2500 | 3000 | 3500 | 4000 | 溶血素对照 | 补体对照 | 血球对照 |
| 溶血素 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | —— | —— |
| 生理盐水 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.50 | 1.50 | 2.00 |
| 1：20补体 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | —— | 0.50 | —— |
| 2.50%红细胞 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 37℃水浴20min | ||||||||||||
| 结果 |
试验中发生全部溶血的溶血素最大稀释倍数（即1︰2000），微溶血素的效价，亦称一个溶血单位。做正式试验时，溶血素按二个单位稀释使用。在本例中，其使用浓度应为1:1000。
3、补体的效价测定 取健康豚鼠3只以上，饲喂前，每只从心脏取血8ml～15ml，注入培养皿内，放入37℃温箱内30min，取出置4℃冰箱内，待血清析出后，吸入离心管中，3000r/min离心15min，取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体，可定量（1ml～2ml）分装于青霉素瓶内，置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也可从兽药厂购买冻干补体，在冰箱内可保存三年。
测定和使用补体时，按表3进行。
| 试管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 对照 |
| 1：20补体 | 0.10 | 0.13 | 0.16 | 1.19 | 0.22 | 0.25 | 0.28 | 0.31 | 0.34 | 0.37 | 0.40 | —— |
| 生理盐水 | 0.90 | 0.87 | 0.84 | 0.81 | 0.78 | 0.75 | 0.72 | 0.69 | 0.66 | 0.63 | 0.60 | 1.00 |
| 一个工作量抗原 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 37℃水浴20min | ||||||||||||
| 致敏血球 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 结果 | 部分溶血 | 全部溶血 | 不溶 |
补体效价测完后，按表添加各种成分。所用的致敏血球是将2单位溶血素和2.50％红细胞液等量混合后，置37℃水浴中15min，即成为致敏血球。
在2单位溶血素的存在下，能使0.50ml的2.50％红细胞完全溶血的最小补体量，即为该补体的效价。在本例中，补体效价为1:20稀释液0.25ml。
效价测完后，按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。0.50/0.25×20.0＝40.00，即此补体应作1:40稀释使用，每管加入0.50ml，此即为1个单位补体。考虑到补体性质不稳定，在操作过程中效价会降低，故此使用浓度比原效价大10.00％左右较为适宜。因此，本批补体应用1︰36稀释使用，每管加入0.50ml。
4、抗原效价测定 鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液，经高压灭菌，并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因，抗原效价可能发生变化，使用前加以滴定。
（1）抗原稀释 用生理盐水将抗原原液作成9种稀释液，方法如表4。
表4 抗原稀释表
（2）血清稀释 取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份，用生理盐水按表5做成5种稀释液，在60℃水浴中灭能30min。
| 稀释倍数 | 10 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 生理盐水（ml） | 9.00 | 9.60 | 9.80 | 7.40 | 9.90 |
| 血清（ml） | 1.00 | 0.40 | 0.20 | 0.10 | 0.10 |
（3）操作法 按表6进行。摆12排反应管，由左向右加入不同稀释度的抗原0.50ml。然后再由上向下，第一排的9个试管各加入1∶10灭能的阴性马血清0.50ml。第二排的9个试管各加入生理盐水0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不同稀释度的强阳性血清0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清0.50ml。所有试管加入一个单位补体0.50ml，混匀后置37℃水浴箱20min取出，每管加致敏血球1.00ml，摇匀后，置37℃水浴20min，取出，观察反应结果。
| 抗原稀释倍数 | 10 | 50 | 75 | 100 | 150 | 200 | 300 | 400 | 500 |
| 抗原（ml） | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 稀释血清（ml） | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 补体（ml） | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 37℃水浴20min | |||||||||
| 致敏血球（ml） | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 37℃水浴20min | |||||||||
| 抗原效价测定的结果根据溶血百分数来判定 |
| 抗原稀释 | 10 | 50 | 75 | 100 | 150 | 200 | 300 | 400 | 500 | |
|
阳 性 血 清 |
1：10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 30 | 30 | 50 |
| 1：25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 | 40 | 40 | 100 | |
| 1：50 | 10 | 0 | 0 | 0 | 10 | 30 | 50 | 50 | 100 | |
| 1：75 | 50 | 20 | 10 | 0 | 20 | 50 | 70 | 70 | 100 | |
| 1：100 | 80 | 80 | 70 | 60 | 90 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| 表注：表中0～100均为溶血的百分比 |
表7是一份强阳性血清测定结果的一个示例。按比例，抗原1︰100稀释液与强阳性血清的各稀释度所发生的抑制溶血现象最强。如果对弱阳性血清的各稀释液的反应亦与此相同，则此批抗原的效价为1︰100，这就是一个抗原工作量。应注意，测定抗原必须用病马阳性血清，不可使用注射鼻疽死菌免疫的兔高免血清。
5、待检血清和对照血清 对照用鼻疽阳、阴性血清可于兽医生物制品厂购买，也可自送检血清中选取。
待检血清采血时，最好在早饲前或在停食后6h，以免血清混浊。采血后，趁血未凝固，将试管斜置，使其凝成斜面。凝固后将试管置于温暖处，使血清析出，经过10余小时，将血清倾入另一干净无菌试管中。如血清析出不良时，可用镍线将血凝块划破，并使之从管壁脱离，放于冷暗处，使血清充分析出。
血清采后最好于1天内送到实验室，最迟不超过3天。若3天内不能送到，应加防腐剂。通常加0.50％石炭酸防腐。试验前，用生理盐水将待检血清稀释10倍，然后在水浴槽内加温灭能30min，马血清加温到60℃。驴、骡血清为63℃～64℃。灭能不但能消除血清中的补体和抗补体作用，且能使它在反应中作用趋于稳定。
二、本试验
预备试验完毕之后，即可进行本实验（参见表8）。
待检血清作1:10稀释，分装两管，各0.50ml。其中一管加抗原，一管不加抗原，作为血清抗补体对照。对照血清用阳、阴性血清各一份。补体加一个单位0.50ml。混合后，置37℃水浴中20min。取出后，所有试管加致敏血球1.00ml，混匀、再于37℃水浴中放20min。取出后，判定结果。
| 试验管 | 待检血清 | 阳性血清对照 | 阴性血清对照 | 抗原对照 | 补体对照 | |
| 试验 | 对照 | |||||
| 1：10血清 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | — | — |
| 抗原（一个工作单位）（ml） | 0.50 | — | 0.50 | 0.50 | 0.50 | — |
| 补体（一个工作单位）（ml） | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 生理盐水（ml） | — | 0.50 | — | — | 0.50 | 1.00 |
| 37℃水浴20min | ||||||
| 致敏血球（ml） | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 37℃水浴20min | ||||||
| 结果（例） | +++ | — | ++++ | — | — | — |
符号记载说明：
++++：90%-100%抑制溶血；
+++：50%-90%抑制溶血；
++：30%-50%抑制溶血；
+：10%-30%抑制溶血；
—：0-10%抑制溶血。
试验结果：阳性血清对照管必须100％抑制溶血，方认为正确。观察反应可使试验结束后进行第一次判定，先将阴性血清判定完。其余血清，可放暗处数小时，待红细胞下沉后，再作第二次判定，较为方便。
在马鼻疽，若反应为“＋＋＋＋”或“＋＋＋”时，可判为阳性；若为“＋＋”或“＋”时判为可疑；若为“－”时判为阴性。
为了判定上的方便，可制出标准溶血管。其制法为：取在本试验中使用的2.50％红细胞混悬液5ml于离心管中，离心沉淀，去上清液，加入20ml蒸馏水，用力振摇，使红细胞完全溶解，再加入5ml 4.50％氯化钠溶液，此为100％溶血液。
取本试验用的2.50％红细胞混悬液5ml，于20ml生理盐水混合，此为100％不溶血的红细胞混悬液。
取11支反应管，其管口粗细应与所用的反应管相一致。按表9加入上述两种成分。
| 试管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100%溶血液 | 2.00 | 1.80 | 1.60 | 1.40 | 1.20 | 1.00 | 0.80 | 0.60 | 0.40 | 0.20 | — |
| 100%不溶血混悬 | — | 0.20 | 0.40 | 0.60 | 0.80 | 1.00 | 1.20 | 1.40 | 1.60 | 1.80 | 2.10 |
| 溶血% | 100 | 90 | 80 | 70 | 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 0 |
| 相当于抑制溶血% | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
