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        PCR技术(PCR ,Polymerase chain reaction)

        互联网

        3498

        PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增倍数可达106。Dr. Karry Mullis 1985年发明,获1993年度诺贝尔化学奖;

        (一)基本要素

        1、Taq DNA聚合酶:

        水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶

        ①5’→3’DNA聚合酶活性;
          ②无3’→5’外切酶活性,
          35轮0.25%错配,与原始模板有差别;
          最适聚合酶 温度72℃,选择72℃延伸
          半衰期:92.5℃ 130mi        95℃ 40min    97.5℃5—6min
          变性温度:≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

        pfu DNA 聚合酶

        耐热
          5’→3’DNA聚合酶活性
          3’→5’外切酶活性
           精确度:pfu >Taq
          但pfu扩增效率通常比Taq酶略       
          文献报道:Taq+pfu 会起到较好效果

        2、Primer 本身不要出现内部互补序列形成loop环,内部二级结构如: GGGTCGATTCCTACCCATGC 

        注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp  

        Primer 5’未端可修饰、突变:修饰,如:32P、生物素、荧光素,不影响其效果;突变:AGCTCCATGACCCAG  5’CGCTCCATGACCCAG   3‘

        注意:绝不可以在3’端进行上述改造 

        ∵DNA聚合酶是5’→3’聚合,若3’端改造→不能互补→不能延伸

        primer  5’端增加碱基
          ATG起始密码  
          TAA、TAG、TGA终止密码  
           如:可溶性受体的表达,无膜内区、穿膜区,只有膜外区。

        3、模板:

        可选:DNA  
          mRNA→逆转录→cDNA 
          DNA包括:  质粒      噬菌体      染色体DNA  
          较小       较大       ①目的gene是单拷贝  
          变性较易   变性较难   ②非常大,变性难  
          模板用量  
          Plasmid:lng  
          Chromosome:300-500ng  
          注意:  防止交叉污染 


        4、dNTP:

        四种脱氧核苷酸,基本原料

        终浓度:50mM 

        5.Mg2+ 

        TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+  ,不同的酶需不同Mg2+  
          Taq:较少,Mg2+对反应影响很大,0.5-1.5mM终浓度  
          pfu:Mg2+ 2-3mM,dNTP、primer用量约增加一倍  
          外界影响: EDTA鳌合Mg2+ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA);DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+结合,降低Mg2+有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想,要注意调整合适的  Mg2+浓度 存时间长会失效

        6、温度和时间:

        (1)变性温度:94-95℃

        Templete:GC比例高、长度很长,则变性T↑

        (2)退火:温度越高,扩增特异性越好

        取决于Tm值:Tm↑退火T↑;
                                  Tm↓退火T↓ 

        若Tm较高,可使退火和延伸在同一温度

        (3)延伸:

        £500nt---1min    >500nt--3min

        一般:40-60sec

        (二)PCR技术的应用

        1. 基因检测:

        2. 基因克隆化

        3. DNA突变

        4. DNA序列分析

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