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        DNA扩增标准化操作规范

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        2648

        1 目的:DNA 扩增标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA 扩增操作。

        2 适用范围:DNA 基因分型实验室。

        3 依据:DNA 扩增标准化操作规范

        4 引用文件:德国BAG公司(以下简称BAG)《Instructions for use Instructions for use HISTO TYPE/DNA -ABDR 384》

        5 程序

        5.1 试剂准备

        5.1.1 BAG® 384 试剂包,包括扩增板、Buffer、读板纸、说明书

        5.1.2 灭菌蒸馏水

        5.1.3 Taq酶

        5.2 仪器及用具准备

        5.2.1 移液器规格:1-10μl ,20-200μl ,200-1000μl

        5.2.2 电动连续加样器

        5.2.3 移液器配套吸头,要求灭菌

        5.2.4 离心管:1.5ml,要求灭菌

        5.2.5 水平式离心机

        5.2.6 配套384板的DNA 扩增仪

        5.2.7 石腊油、平皿

        5.2.8 中性记号笔

        5.2.9 手套,规格:乳胶手套,与操作者手形相适应,经灭菌

        5.3操作步骤:

        5.3.1 换工作服、戴手套

        5.3.1.1 从工作服衣柜中换取专用工作服,戴上适应自己手形的乳胶手套。

        5.3.2 扩增混合液的配置

        5.3.2.1 选择DNA

        浓度要求大于20ng/μl,A260/A280要求在1.60 至2.0之间的DNA 方可

        每4个DNA 样品为一组。

        5.3.2.2 核对DNA 抽提记录,确认需要扩增的DNA 号码正确无误

        5.3.2.3 计算每个混合液的组成:

        Buffer:106μl

        DNA 量原则:要求每个样本有5-8μgDNA ,一般原则如下:

        DNA 浓度(ng/μl)DNA 量(ul)

        10 ― 40 200

        40 ― 80 102

        80以上70

        酶每个样本DNA 要求35U,酶量计算公式:酶量= 35/ 酶活性单位/μl

        H2O量计算:H2O量=1060-酶量-buffer-DNA 量

        混合液总体控制在1060μl左右

        记录以上配制信息

        5.3.2.4 取1.5ml 离心管,按照配制记录上DNA 顺序放置DNA 和空离心管,使两者一一对应,用记号笔标记DNA 号到对应的空离心管上

        5.3.2.5 检查确认空离心管上的DNA 号码准确无误

        5.3.2.6 按照配制记录,以(1)Buffer(2)H2O(3)Taq酶(4)DNA 的顺序依次将各反应成分加入离心管中,要防止交叉污染。注意(1)(2)(3)三种成份,每加入一种成份换一次枪头,DNA 模板每加一管换一次枪头。盖上离心管的盖,混匀。

        5.3.2 加样扩增

        5.3.2.1 从-20℃的冰箱中拿出384干板放于室温一段时间,待干板回到室温后,用油性记号笔在6列和7列、12列和13列、18列和19列之间各画一条记号线进行样品间的划分。调节连续加样器,使每次加样的量为10μl,可以连续加样10―50次。从每个样品的左上第一孔连续加入10μl。注意加样的枪头不要与底部的引物接触,以避免带入其他孔的引物而影响实验结果。因此,加样时,应加在靠近孔口处,让液体自然流下。

        5.3.2.2 加样完成后,使用粘性耐热膜封严384干板。先打开耐热膜的一端,对应的贴在384干板的一端,然后沿贴的一端,一边打开耐热膜,一边紧紧的贴在板上,最终整块粘性耐热膜完全牢牢粘贴在384干板上。用记号笔在板上正确记录样品号,保证无误后,2000rpm离心5分钟。如果不是马上扩增,可以加样后暂不离心,放入冰箱保存,待扩增时再离心,但时间不宜过长。

        5.3.2.3 扩增前,取出干板,放到PCR头上,保证孔对孔;加盖胶垫,拧紧PCR头的盖子上的旋钮,以操作者感到旋钮吃紧即可。设定指定的扩增程序即可扩增。

        5.3.2.4 约100分钟后,扩增完成。打开PCR仪热盖,取下384板,放入冷藏冰箱或立即电泳。

        5.3.2.5 关上PCR仪。

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