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        聚乙二醇沉淀法检测循环免疫复合物

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        实验原理

         

        一定浓度的MW6 000~8 000的聚乙二醇(PEG),能沉淀免疫复合物,但不能沉淀正常球蛋白,沉淀的免疫复合物可用放射免疫法或用分光光度计测定其含量。

        实验试剂

         

        1. 0.1mol/L硼酸盐缓冲液称取硼砂0.64g,硼酸0.51g溶解于100ml蒸馏水中,pH值8.4。

        2. 6%PEG取6gPEG(MW6 000),溶于100ml硼酸盐缓冲液中。

        3. 氯化铯溶液称取CsCl 1g,溶解于14ml蒸馏水中。

        4. 热凝聚IgG、试验血清、毛细沉淀管(3×60mm)等。

        实验步骤

         

        1. 取被检血清作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释,同时稀释热凝聚IgG,并设缓冲液对照。

        2. 各管加6%PEG溶液,混合,4℃过夜。

        3. 取细沉淀管,各管加氯化铯溶液约10μl,上层加各种稀释血清,3000r/min离心10min

        4. 取出,对着黑色背景观察,在两液交界,如出现白色沉淀环即为免疫复合物阳性。热凝聚IgG对照也应出现不同程度的沉淀环,缓冲液对照不出现环状沉淀。

        热凝聚IgG制备方法:

        全部免疫复合物检测阳性对照,均可用热凝聚IgG,其制备方法如下。

        1. 取Cohn’sFⅡ球蛋白(或纯化IgG)1g,溶解于100ml 0.15mol/L生理盐水中,放室温2~3h。

        2. 放63℃水浴中加热12min。

        3. 分次(每次1g)缓慢加入67gNa2 SO4 ,放4℃ 1h。

        4. 取出后,2 000 r/min离心20min。

        5. 将沉淀物溶解在适当的缓冲液中(如CFD缓冲液,C1q缓冲液等),并用相同的缓冲液透析一昼夜。最后稀释至含蛋白量约为12~15mg/ml,保存于-20℃备用,用时将蛋白含量稀释至1mg/ml。

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