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        免疫沉淀

        相关实验：蛋白质分离和分析

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

         

        基 本 方 案 1 用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀

        材 料

        未标记或标记的细胞悬液

        P B S ，冰预冷

        非变性裂解缓冲液，冰预冷

        5 0 % (V A O protein A-Sepharose 填 料（Sigma， Amersham Pharmacia Biotech)保存于含 0.1% (m /V ) B S A 和 0,01% (m /V ) 叠 氮 钠（N a N 3) 的 PBS 溶液中

        特异性的多克隆抗体（抗血清或亲和层析纯化的免疫球蛋白）或 单 克 隆 抗 体（腹水 、细胞培养上清或纯化的免疫球蛋白）

        特异性抗体的对照抗体（如免疫前血清或制备特异性多克隆抗体纯化的无关免疫球蛋白、无关腹水、杂交瘤培养上清或制备特异性单克隆抗体纯化的无关免疫球蛋白）

        10 % (m /V ) B S A

        洗涤缓冲液，冰预冷

        转子角度固定的微量离心机（Eppendorf 5415C 或相似类型）

        试 管 旋 转 器（能够来回颠倒）

        连接真空抽滤装置的巴氏吸管

        1.将细胞悬液（0.5X 107〜2 X 107 个 细 胞 获 得 I m l 裂解液）放 入 一 个 15m l 或 50m l 带螺帽的锥底离心管中 4°C ， 400 g 离 心 5 min。将试管置于冰上，用连接真空抽滤装置的巴氏吸管吸出上清液。

        2 . 轻拍试管底部重悬细胞。冰 预 冷 P B S 如 步 骤 1 所述清洗细胞两次，所 用 P B S 的体积与原先的细胞培养体积相同。
        图 12. 2 . 1 基本方案1 中描述的免疫沉淀过程的图释。（1 ) 细胞裂解：用去垢剂或不用去垢剂 抽提细胞使抗原溶解。为了提高免疫沉淀反应的特异性，可 用 protein A-agarose胶粒预清除细 胞裂解液。（2 ) 抗 原 固 定 ：某 一 特 异 性 抗 体 结 合 至 protein A-agarose胶 粒 上 。 （3 ) 抗原捕捉: 可溶性的抗原通过偶联抗体的胶粒被分离。

        3 . 加 入 I m l 冰预冷的裂解缓冲液至 0.5X 107〜2 X 107个细胞，用中等速度旋转混合器轻 轻 旋 转 试 管 3s，重 悬 细 胞 沉 淀 。将 细 胞 悬 液 冰 浴 15〜 30m i n 后 ，转移至一个1.5m l 锥底微量离心管中。 4°C ， 16 OOOg (最大转速）离 心 15m i n 澄清裂解液。为了减少免疫沉淀的背景，如果需要，可将裂解液 10 超速离心 lh。

        4 . 用安装了一次性吸头的可调节吸管将上清液转移至一干净的微量离心管中。不要搅动沉淀，并 残 留 20〜40ul 上清液在离心管中。将澄清的裂解液冰浴直到预清除（步
        骤 1 0 ) 或加入抗 体 胶 粒 （步 骤 11)。或者，一70°c冷 冻 储 存 细 胞 沉 淀 （步 骤 2 ) 或细 胞抽提液直到进行免疫沉淀。 在 一 个 I.5m l 锥底微量离心管中，将 30^1 5 0 % protein A -Sepharose填料， 0 •5m l 冰 浴 的 P B S 和下列定量的特异性抗体（选择一种）进行混合： 1〜5/xl多克隆抗血清 lMg 亲和层析纯化的多克隆抗体 0. 2〜Im I含相应单克隆抗体的腹水 IiLtg纯化的单克隆抗体 20〜100/^1含相应单克隆抗体的细胞培养上清。 如 果 抗 体 来 源 的 种 系 或 亚 群 不 与 protein A ( 表 12. 2 . 1 ) 结 合 ，那 么 可 用 protein G 取代 protein A 。
        6 . 在 1.5m l 微量离心管中建立一非特异性免疫沉淀对照，将 30^x1 5 0 % protein A 填 料 ， 0.5m l 冰浴的P B S 和 合 适 的 对 照 抗 体 （利用与特异性抗体相同的物种抗体）进行 孵育 ： 1〜5/xl免疫前血清作为多克隆抗体血清对照； Ijug纯 化 的 无 关多克隆抗体（此抗体针对的抗原表位不存在于细胞裂解液中） 作为纯化的多克隆抗体对照； 0. 2〜1/xl包含有无关单克隆抗体的腹水（此抗体针对的抗原表位不存在于细胞 裂解液中，并且此抗体与特异性抗体是相同种属和亚群的免疫球蛋白）作为包含有 特异性单克隆抗体腹水的对照； 1/xg纯化的无关单克隆抗体作为纯化的单克隆抗体的对照； 20〜100^1包含有无关单克隆抗体的杂交瘤培养上清作为包含有特异性单克隆抗 体的杂交瘤培养上清的对照。 7 . 充分混合悬液。在 4°C 试管旋转器上来回旋转孵育混合物> l h (可 持 续 至 24h )， 4°C ， 16 OOOg (最大转速）微量离心机离心2s。 8 . 用连接真空抽滤装置的比较精细的巴氏吸管吸出上清液（包含有未结合的抗体）。加 入 I m l 非变性的裂解缓冲液至沉淀中，上下颠倒3 或 4 次重悬沉淀。 对 于 用 去 垢 剂 制 备 的 裂 解 物 （此 方 案 和 备 选 方 案 1 和 2 中）， 加 入 I m l 非变性的 裂 解 缓 冲 液 ；对 于 机 械 破 碎 的 裂 解 物 （见 备 选 方 案 3 中）， 加 入 无 去 垢 剂 的 裂 解 缓 冲 液 。 9 . 微量离心洗涤沉淀，并用非变性的裂解缓冲液重悬沉淀，吸出上清液。 10•可选操作：在一微量离心管中，将 I m l 裂 解 液 （来 自 步 骤 4 ) 与 30jul 5 0 % protein A -Sepharose填料混合，从而预清除裂解液。在 4°C ，试管旋转器上来回旋转混合 物3〇 111丨11。 4°(：， 16 00(^(最大转速）微量离心机离心51^11。 如 果 裂 解 液 从 表 达 免 疫 球 蛋 白 的 细 胞 如 脾 细 胞 或 培 养 的 B 细 胞 制 备 获 得 ，则至 少 需 要 重 复 3 次 预 清 除 步 骤 ，以 确 保 完 全 去 除 内 源 性 的 免 疫 球 蛋 白 。 11. 加 入 IOmI 1 0 % B S A 溶液至装有结合了特异性抗体的填料的试管中（步 骤 9)，并将 此混合物转移至裂解液的试管中（来 自 步 骤 4 或 步 骤 10)。如果需进行平行的非特 异性免疫沉淀对照，则需将裂解液分成两份，每 份 约 〇 .4m l ，一份用于进行特异性 抗体免疫沉淀，另一份进行非特异性的对照组实验。在 4°C ，试管旋转器上充分混 合悬液，并 孵 育 1〜2h 。 12. 4°C ， 16 000^ (最大转速）微量离心机离心5s。用连接真空抽滤装置的比较精细的 巴氏吸管吸出上清液（包含有未结合的蛋白质）。如果需要，可 将 上 清 液 4°C 储存 8h 或一70°C 储 存 1 个月，然后进行抗原的免疫沉淀实验或上清液总蛋白质的分析实 验 。 为 了 再 利 用 裂 解 液 ，用 安 装 了 一 次 性 吸 头 的 可 调 节 吸 管 将 上 清 液 小 心 吸 出 。进 行 再 次 免 疫 沉 淀 实 验 前 ，用 protein A-Sepharose (如 步 骤 1 0 所 述 ） 预 吸 附 裂 解 液 ， 以 便 去 除 在 进 行 第 一 次 免 疫 沉 淀 过 程 中 解 离 出 来 的 抗 体 。 13. 加 人 I m l 冰预冷的洗涤缓冲液至沉淀，盖上试管盖，上下颠倒试管3 或 4 次重悬填 料。 4°C ， 16 OOOg (最大转速）微量离心机离心2s。 吸出上清液，残留20/xl上清液
        在试管中。 14. 至少清洗沉淀3 次 ，每次清洗时需将样品冰浴3〜5min。 15. 用 Iml P B S 至少清洗沉淀1 次 ，用巴氏吸管或安装了一次性吸头的可调节吸管将上 清液完全吸出，保 留 15M1包含有结合了抗原的沉淀。如果需要，一20°C 储存。 16.进 行 单 向 电 泳 （单 元 12. 3)、双向电泳或免疫印迹（单 元 12. 5 ) 分析免疫沉淀物。 参 考 本 单 元 末 表 12. 2. 2 检 查 故 障 原 因 及 疑 难 解 答 。 备 选 方 案 1 用含非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞进行免疫沉淀 附 加 材 料 （其他材料见基本方案 1) 未标记或标记的在细胞培养板上的单层细胞 橡胶细胞刮棒 1 . 冰预冷P B S 洗涤黏附在细胞培养板上的细胞两遍，用连接真空抽滤装置的巴氏吸管 吸 出 P B S 。 2 . 将细胞培养板冰浴，并加入冰预冷裂解缓冲液（如 I O O m m 直径的培养板加入I m l 裂 解液）。 3 . 用橡胶细胞刮棒将细胞刮下，并用安装了一次性吸头的可调节吸管将细胞悬液转移 至 1.5m l 锥底微量离心管中，轻轻旋转3s 后 ，将试管冰浴15〜30min。 4 . 澄清裂解液后进行免疫沉淀（见基本方案1 ，步 骤 4〜1 6 ) 。 备 选 方 案 2 用含变性去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 此方案仅采用能与变性蛋白质反应的抗体进行可溶性蛋白质的免疫沉淀。 附 加 材 料 （其他材 料 见基 本 方案 1 ， 带V 项 目 见 附 录 1) V 变性裂解缓冲液 设 置 在 95°C 的 加 热 器 （Eppendorf热混合器5436或相似类型） 连 接 25G 针 头 的 I m l 注射器 1 . 收集悬浮培养的细胞（见基本方案1，步 骤 1〜2)，将其冰浴。 2 . 每 0.5X 107〜2 X 107个细胞加入IOOm I变性裂解缓冲液，最大速度旋转试管2〜3s 后 重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5m l 锥底微量离心管中，在 95°C 加热器中加热样 品 5min0 3 . 用 0.9m l 非变性的裂解缓冲液稀释悬液，小心混合样品。将 细胞悬液通过连接 25G 针 头 的 I m l 的注射器5〜1 0 次 ，直至溶液黏性降低，从而剪切D N A 。 4 . 将悬液冰浴5min。 5 . 澄清裂解液后进行免疫沉淀（见基本方案1 ，步 骤 4〜1 6 ) 。 备 选 方 案 3 用无去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 附 加 材 料 （其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 ， 带V 项 目 见 附 录 1) V 无去垢剂的裂解缓冲液
        Ommol/L T r is . C l， pH7.4 (备选） 连 接 25G 针 头 的 3m l注射器 1 . 收集细胞悬液并清洗细胞（见基本方案1 ，步 骤 1〜2)。 2 . 每 0 . 5X 107〜2 X 107个细胞沉淀加入Im l冰预冷无去垢剂的裂解缓冲液。用中等速 度的旋转混合器小心旋转3s 重悬细胞。 3 . 备选：如果细胞能够承受机械破碎，则在机械破碎前用低渗溶液（10mmol/L T d s . Cl， pH7. 4 ) ， 4°C 溶胀细胞 lOmin。 4•将细胞悬液快速通过连接25G 针头的3m l 注射器15〜2 0 次以破碎细胞，切记避免溶 液飞溅和起泡。 5 . 澄清裂解液后进行免疫沉淀（见基本方案1 ， 步 骤 4〜 16)。 备 选 方 案 4 用抗体-Sepharose进行免疫沉淀 此方案依赖于蛋白质抗原与共价结合到Sepharose上的抗 原 特 异 性 单 克 隆 （或多克 隆）抗体形成不溶的免疫复合物（图 12. 2. 2)。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 未标记的细胞，表 面 标 记 的 细 胞 （如用125I 或 生 物 素 标 记 ），或 生物合成的35S 、 3H 、14C 标记的细胞 VTriton X -IOO裂解缓冲液 V 稀释缓冲液 抗 体 （Ab)-Sepharose (见辅助方案1) 活 化 的 淬 灭 （对照） Sepharose，用于制备Ab-Sepharose (见辅助方案1)，但去除 了抗体或偶联时用无关抗体替代 V T S A 溶液 V 0. 05mol/L Tris •Cl? pH6. 8 X S D S 样品缓冲液 1 . 用丁汾〇111-10()裂解缓冲液4°(：孵 育 细 胞 （5 \ 1 0 7个细胞/1111)111。 2. 300(^离心裂解液lOmin，去除核酸并保留上清液。 3. 100 OOOg离心上清液lh，保留上清液。切记放射性标记物的半衰期，确保上清液在 几 天内使用完毕，否则需要将其储存于一70°C 。要避免上清液的反复冻融。 4 . 每 200/^1上清液中加入10/xl活 化 的 淬 灭 （对照） Sepharose进行同一批次上清液的预 清除。定轨摇床室温振荡2h 或 4°C 振荡过夜后， 200g 离 心 Im in并储存上清液。 5•室温下用Triton X -100裂解缓冲液预包被1.5m l 微 量 离 心 管 lOmin，以减少蛋白质 吸附。吸去包被溶液。 6 . 在预包被的微量离心管中加入IO5〜IO6C p m 包 含 有 放 射 性 标 记 抗 原 （125I 或35S) 的 上 清 液 （来自步骤4)，并用稀释缓冲液将终体积定容至20(^1。对于未行放射性标记 的样品，则 加 入 0.2〜I m l 的预清除裂解液。 7•加入IOjul的 I : I A b -Sepharose/稀释缓冲液， 4°C 定轨摇床振荡I.5h 。 8•用I m l 下列缓冲液洗涤Ab-Sepharose。 每次清洗后， 200g 离 心 Imin或微量离心5s。
        图 12. 2.2 利 用 Ab-Sepharose (左边，参考备 选 方 案4 ) 或 抗 Ig血 清 （右 边 ，参考备选 方 案 5 ) 进行免疫沉淀的图释。①细胞裂解。②利用共价偶联了特异性抗体的Sepharose (左边）或利用与抗Ig血 清 结 合 的 特 异 性 抗 体 （右 边 ）进行免疫沉淀。③清洗。④在样 品缓冲液中抗原-抗体复合物解离以便进行电泳。 然后，用比较精细的巴氏吸管小心吸出上清液，并残留IOfxl液体在试管中。第四次 清洗后，将管壁上残留的液体再次离心下来，吸出上清液并残留10/xl液体在沉 淀上。 稀释缓冲液 T S A 溶液 0•05mol/L Tris •C l， pH6. 8 。 9•加入20〜50M1 2 X S D S 样品缓冲液。因为样品缓冲液密度比稀释缓冲液较高，所以 它将沉降至Sephamse下面；不要旋转试管，因 为 缓 冲 液 上 面 的 黏 附 到
        管壁上。小心地盖上试管盖并于l〇〇°C 孵 育 5min。 10. 200g 离 心 Imin或微量离心5s。将上清液上样，并小心避免Sepharose进入电泳道， 然后进行SDS-P A G E 分 析 （单 元 12. 3)。 11.用放射性自显影检测（125I) 标记的蛋白质，用 荧 光 自 显 影 检 测 （35S 、14C 或3H ) 标 记的蛋白质，或用比色法或化学发光检测（生物素标记的蛋白质）。 辅 助 方 案 抗 体 Sepharose的制备 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 1〜30m g / m l 抗原特异性的单克隆抗体或多克隆抗体 0. lmol/L N a H C O 3/ 0. 5mol/L NaCl Sepharose C L -4B (或 对 于 髙 分 子 质 量 的 抗 原 采 用 Sepharose C L -2B ; Amersham Pharmacia Biotech) 0. 2mol/L N a 2C O 3 V 溴 化 氰 （C N B r ) /乙腈 lmmol/L 和 0 •lmmol/L H C 1，冰预冷 0.05mol/L 甘 氨 酸 （乙醇胺）， p H 8. O V T S A 溶液 透 析 袋 （分子质量排阻> 1 0 〇〇〇) Whatman 1 号宽滤纸 布氏漏斗 锥形过滤瓶 水泵 1.将 1〜30mg/ml 的抗体在 4°C 对 0 •lmol/L N a H C O 3/ 0 •5m 〇l/L NaCl 溶液透析，透 析 24h ，换 液 3 次。透析溶液的体积是抗体溶液体积的500倍 。 4°C ， 100 OOOg离心 lh，去除沉淀，保存上清液。 2 . 测 定 上 清 液 的 A 28q 吸 光 值 ，并 确 定 抗 体 的 浓 度 （m g / m l I g G = A 28()/1.44)。用 0 •lmol/L N a H C O 3/ 0 •5mol/L N a C l 溶 液 稀 释 抗 体 浓 度 至 5mg/ml (或达到制备 A b -Sepharose所需的抗体浓度）， 4° C 保 存 抗 体 溶 液 并 测 定 其 A 28q吸光值以备步骤 8 用 。 3 . 将 Sepharose填料放在烧杯中自然沉降，然后弃去上清液。称 出所需的 Sepharose填 料 量 （估计密度= 1.0)。 4 . 用 W h a t m a n l 号滤纸在布氏漏斗中组装一个过滤装置，并将一个锥形过滤瓶与水泵 连接，在过滤装置中用1 0 倍体积的水清洗Sepharose填料。 5 . 将 Sepharose填料转移至50m l 的烧杯中，加入等体积的0.2mol/L N a 2C O 3溶液。室 温条件下，在通风橱里活化Sepharose，每 100ml Sepharose溶 液 加 入 3. 2ml C N B r / 乙 腈 溶 液 （2g C N B r /100ml Sepharose)。用巴氏吸管逐滴加入C N B r /乙腈溶液lml， 并用磁力搅拌器缓慢搅拌勻浆液，持续搅拌5min。 2〜4g CNBr/lOOml Sepharose 能够偶联 1〜 20m g 抗 体 /ml Sepharose。
        6•如步骤4 所述快速过滤C N B r 活化的Sepharose，抽 吸 至 半 干 状 态 （即抽吸至Sepharose填料积压成堆）。先 用 10倍体积的冰预冷的lmmol/L H C l ，再 用 2 倍体积的冰 预冷的0. lmmol/L H C l 清洗填料。然后用足够量的冰预冷的0 •lmmol/L H C l 水化 填料，但所用液体量不要超过填料上表面。 7 . 立即称取所需的填料量（估计密度= 1.0)，并转移至一烧杯。然后加入等体积的溶 解 在 0. I m o V L N a H C O 3/ 0.5mol/L N a C l 中 的 抗 体 溶 液 （来 自 步 骤 2)。用磁力搅拌 器或旋转混合器室温缓慢搅拌2h 或 4°C 搅拌过夜。 8 . 加 入 0.05mol/L 甘 氨 酸 （或乙醇胺）溶 液 （p H 8 . 0 ) 中 和 Sepharose填料上仍处于 活化状态的基团，并 将 填 料 悬 液 自 然 沉 降 。吸 出 部 分 上 清 液 后 ，离心去除残佘 Sepharose填料，并测定上清液的A 28 q 吸光值。与 步 骤 2 的 A 28q 吸光值进行比较，从 而确定偶联率。用 T S A 溶液储存A b -Sepharose填料。 备选方案5 用与A N T M g 结合的放射性标记的抗原进行免疫沉淀 此方案仅适用于放射性标记的或生物素标记的抗原，因为未标记的抗体会保留在免 疫沉淀物中，这使得使用其他检测方法很困难。 附 加 材 料 （其他材料见备选方案4) 正常血清 抗 Ig 血 清 (Zymed Laboratories) 抗原特异性的抗血清或抗原特异性的纯化的单克隆抗体或抗原特异性的杂交瘤培养 上清 遵循备选方案4 的步骤，在指定的步骤进行以下的修饰： 4a. 每 m l 放射性标记的抗原加入2M1正常的血清进行预清除，然后加入适量的抗Ig血 清 ， 4°C 放 置 12〜18h 后 ， IOOOg离 心 lOmin，储存上清液。 正 常 血 清 是 载 体 Ig 的 主 要 来 源 ， 抗 Ig 血 清 的 量 必 须 用 放 射 性 标 记 的 抗 原 或 Ig 滴 定 确 定 。 对 于 高 效 价 的 抗 Ig 血 清 ， 使 用 的 量 将 是 20X 〜 40 X 抗 原 特 异 性 抗 血 清 的 量 ， 或 2 〜 4 M 1 / Mg 纯 化 的 单 克 隆 抗 体 ， 或 1 / 3 杂 交 瘤 培 养 上 清 的 量 。 7a. 加 入 IiUl抗原特异性的抗血清， 3jug抗原特异性的纯化的单克隆抗体，或抗原特异 性的杂交瘤培养上清（30]ul克隆化系或未克隆化系）。混 合 后 在 4°C 放 置 2h 。然后 加入适量的抗Ig血清，混合后在4°C 放 置 12〜18h 。 8a•如前所述，洗涤免疫沉淀物，但不要在l 〇〇〇g 离 心 7min。 9a. 加 入 20〜50p l 2 X S D S 样品缓冲液，不要摇晃，因为免疫沉淀物将会再黏附到缓冲 液面上的管壁上。小心盖上试管盖，先 在 56°C 孵 育 I h 使得免疫沉淀物解离，然后 在 100°C 孵育 5min。 基 本 方 案 2 再次捕获免疫沉淀 抗原经免疫沉淀分离后，它可从免疫沉淀物中解离出来，然后用与第一次免疫沉淀 相同或不同的抗体进行再次的免疫沉淀（再次捕获）（图 12. 2. 3)
        图 12. 2. 3 再次捕获进行免疫沉淀的图释。 （1 ) 抗原的 解 离 和变性：用 与 protein A-agarose 胶粒结合的抗体1 免疫沉淀抗原后，然 后 在 SDS和 D T T 存在的条件下加热免疫沉淀物，使 得抗原 解 离 并变性 。 ( 2 ) 抗 体 2 的固定：将 抗 体 2 结 合 到 protein A-agarose胶粒上。 （3 ) 再 次捕获：抗 原 2 (斜纹椭圆形）被结合 到protein A-agarose上 的抗体2 再次捕获。此 外 ，抗 体 1 可用来针对原先的抗原（正方形）进行进一步的纯化

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        来源：丁香实验

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