• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构：
    • 成为企业机构
    • 个人用户：
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        土壤微生物DNA提纯方法及纯度检测

        互联网

        2708

        实验试剂

         

        DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3 PO4 , 1.5 M NaCl, pH 8.0)

        溶菌酶(50 mg/mL)

        蛋白酶K(20 mg/mL)

        10% SDS

        RNAse 20 mg/mL

        聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)

        交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)

        TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

        PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2 HPO4 , 2 mmol/L KH2 PO4 , pH 7.4)

        NaOH溶液

        10% HCl

        TE缓冲液(pH 7.6)

        氯仿

        异戊醇

        异丙醇

        实验设备

         

        高速离心机

        PVPP离心柱

        Sephadex离心柱

        Sephadex G-200树脂

        3S DNA Purification Kit纯化柱

        电泳槽

        电泳仪

        2 mL、1.5 mL离心管

        实验材料

         

        10 g土样的粗DNA样品

        实验步骤

         

        1. 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)在DNA提取过程中的纯化作用比较

           (1) 称取0.1 g土样，置于2 mL灭菌的离心管中，直接加入500 μL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3 PO4 , 1.5 M NaCl, pH 8.0)，10 μL溶菌酶(50 mg/mL)，2.5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，37℃水浴30 min，加100 μL 10% SDS 65℃水浴1 h，8 000 r/min离心5 min，上清用等体积氯仿:异戊醇抽提后用0.6 倍体积异丙醇沉淀，30 μL ddH2 O(含RNAse 20 mg/mL)溶解；

           (2) 称取0.1 g土样加入0.1g PVPP，加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

           (3) 称取0.1 g土样加入0.1g PVP，加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

           (4) 称取0.1 g土样加入1 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)，涡旋混匀5 min，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀反复洗两遍或至上清基本近无色，再用1 mL PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2 HPO4 , 2 mmol/L KH2 PO4 , pH 7.4)缓冲液洗一遍，然后再加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

           (5) 称取0.1 g土样加入1 mL TENPP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVPP, pH 10.0)，其余同(4)。

        0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

        2. 柱纯化

           (1) PVPP离心柱：将1 g酸化PVPP(用10% HCl煮沸10分钟，NaOH中和后再用水洗直至中性晾干即可)加入1 mL离心柱上，将离心柱放在1.5 mL离心管上，加入1 mL TE，10 000 r/min离心1 min，倒空离心管再重复离心一次脱干PVPP。将离心柱放在新的1.5 mL离心管上。将100 μL粗DNA在PVPP离心柱上，10 000 r/min离心1 min；

           (2) Sephadex离心柱：Sephadex G-200树脂用TE缓冲液(pH 7.6)在4℃平衡过夜，将细碎的颗粒去除。在1 mL离心柱上加入500 μL平衡后的Sephadex G-200凝胶，3 000 r/min离心直至凝胶体积不再变化。加入100 μL粗体DNA样，3 000 r/min离心1 min；

           (3) 结合Sephadex柱和PVPP柱：取100 μL粗DNA样品，经PVPP柱10 000 r/min离心1 min，再经Sephadex柱3 000 r/min离心1 min；

           (4) 商品纯化柱：使用3S DNA Purification Kit纯化柱，将100 μL粗DNA以PCR产物方式按照说明进行纯化，必要时使用BS缓冲液反复漂洗2~3次，30 μL ddH2 O回收。

        0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

        3. 电泳法：

           (1) 低电压长时间电泳法：1%琼脂糖凝胶电泳在25 V进行4~8 h以上；

           (2) PVP电泳法：在1%琼脂糖凝胶中加入2% PVP，25 V进行电泳4~8 h以上；

        电泳结束后切下DNA主带，用凝胶回收试剂盒进行胶回收。

        0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

        ad image
        ad image

        相关产品推荐

        硅胶膜型基因组DNA提纯试剂盒（50次）

        硅胶膜型基因组DNA提纯试剂盒（50次）

        ￥300

        土壤生物学指标检测|土壤有机质检测|土壤微生物量碳检测

        土壤生物学指标检测|土壤有机质检测|土壤微生物量碳检测

        ￥200

        葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)

        葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)

        ￥170

        动物组织DNA抽提纯化试剂盒（Exgene Tissue SV (plus!)）

        动物组织DNA抽提纯化试剂盒（Exgene Tissue SV (plus!)）

        询价

        质粒DNA快速抽提纯化试剂盒（Hybrid-Q Plasmid Rapidprep）

        质粒DNA快速抽提纯化试剂盒（Hybrid-Q Plasmid Rapidprep）

        询价

        相关问答

        问

        土壤病毒DNA提取要点

        282 围观
        2023-10-31

        问

        做土壤微生物的，需要定量检测土壤中某一真菌的生物量。

        4 回答 985 围观
        2023-05-07

        问

        Chip提纯DNA问题

        2 回答 1501 围观
        2023-01-15

        相关方法

        厌氧微生物培养方法

        重结晶提纯实验

        盐析法提纯抗体

        推荐阅读

        土壤总DNA的几种提取方法

        提取土壤总DNA的几种方法

        土壤微生物总DNA提取及纯化

        无忧采购 轻松科研

        无忧采购 轻松科研

        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序