免疫固定电泳技术的应用体会

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【摘要】  免疫固定电泳广泛用于单克隆蛋白的鉴定和分型，其敏感性高、分辨率好，但也有很多影响因素。通过应用Microgel 696PC全自动电泳仪对免疫固定电泳的实验，总结经验，避免不良因素的干扰，便于正确地分析结果。

【关键词】  免疫固定电泳 单克隆蛋白 体会

 

 

　　免疫固定电泳（IFE）包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程，它周期短，结果易于分析，敏感性和分辨率强。目前已经取代了传统的免疫电泳技术，成为单克隆蛋白（M蛋白）鉴定和分型的首要方法。意大利Interlab、美国Helena、法国Sebia都推出了便捷的自动化电泳系统，其原理和方法基本相同，现以Interlab公司的Microgel电泳系统为例，对IFE应用的体会如下。

　　1  标本留取

 

 

　　标本可以是血标本，尿液或脑脊液。血标本要求清晨空腹抽取的静脉血，分离血清，忌用溶血标本及血浆标本；最好也不要用有隔离胶和促凝剂的血清管，某些特殊患者的血清和隔离胶混在一起，不能分离，笔者就曾遇到过2例。尿标本必须清洁无污染，24 h尿标本最适合检测，也可使用晨尿。脑脊液标本须新鲜无污染，较少用于常规实验室。

 

　　2  标本保存

 

 

　　血、尿和脑脊液标本在2℃～6℃可保存72 h，在此条件下，对免疫球蛋白影响不大。若短期不进行实验，可在-20℃条件下可保存1个月。避免反复冻融，使免疫球蛋白的结构发生改变。勿使用放置过久的标本，比如放置过久的尿液中会有降解蛋白的出现而影响结果。

 

　　3  电泳的影响因素

 

 

　　3．1  仪器参数的设定  

 

　　Microgel系统分析IFE的过程是一个半自动的过程。其分析步骤包括点样、区带电泳、人工处理、变性、洗涤、染色、脱色和烘干。除人工处理这个步骤之外，其他都是通过Microgel系统自动完成的。Microgel系统可对电泳进行参数的设定，包括电压、电流、时间、功率等，但在大多数情况下，我们采用厂家推荐的程序设置，如若电泳时间过长，导致白蛋白的丢失；电泳时间过短，又不能使蛋白较好的分离。

　　3．2  成品试剂盒的使用 

　　试剂盒提供的加样盘为一次性，从而避免交叉污染。盐桥为真空封闭包装，在实验前方可打开包装，确保每次实验条件相同。脱色液、洗液、染液按规定比例进行稀释，稀释后的脱色液在室温下可稳定2周，稀释后的洗液和染液室温下可稳定6个月。每次实验中的染液经过机器内部循环后自动回收，每进行10个循环（10次实验）后，须更换新染液。封装的琼脂糖凝胶胶片应在室温下予保存，水平放置，有变质的情况下不能够使用。

 

 

　　3．3   实验前标本的处理  

　　高浓度球蛋白的存在，会使得免疫反应中的沉淀溶解，导致中心区蛋白不着色，从而导致“口形”现象出现。所以实验前应调节免疫球蛋白的浓度，这是IFE最为重要的前提。一般情况下，当免疫球蛋白的浓度超出正常范围时，将该泳道的标本用标本稀释液稀释到5 g/L，再与抗血清反应；在轻链球蛋白浓度较高时，最高将该泳道的标本稀释3倍；对照泳道不必稀释。尿标本的处理主要看尿中总蛋白的水平，一般浓缩尿标本至总蛋白水平为1 g/L，使用浓缩标本检测。在某些特殊病例中，还需要对尿液进行稀释以避免干扰。如果尿标本的盐浓度高，还应将尿液进行透析处理。

　　3．4   操作的影响因素  

 

　　加抗血清时，要快速且均匀，保证每个泳道的抗血清完整充盈在凝胶表面。若只使用一张胶片时，在模具底座的另一侧也要放同样数量和类型的吸纸使胶片受力均匀。在孵育结束后，及时清洗模具，防止堵塞加样孔。整个电泳过程结束后，应按标准操作规程对仪器维护。在观察结果前，有必要时用含有乙醇的海绵擦拭胶片的背面。