（交流）免疫细胞化学技术 讲座

免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述
~undefined免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)
-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
(一) 对抗原和抗体的要求
~undefined具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求：纯度高、比活性强；
~undefined高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
(二) 抗原 (antigen, Ag)
~undefined抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
~undefined根据抗原是否显示免疫原性分为：
-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
~undefined免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
~undefined半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
~undefined通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体 (antibody, Ab)
1、抗体的概念：
~undefined机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内；
-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
~undefined单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
~undefined多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低，会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
~undefined动物的选择
~undefined佐剂(adjuvant)
~undefined免疫方法
~undefined免疫剂量
~undefined抗体效价的测定
~undefined放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
~undefined所需抗血清的量
-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
~undefined能供免疫用的抗原量
-小鼠50g足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
~undefined动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
~undefined一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
~undefined最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
-弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)
-弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
~undefined是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
~undefined使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)
~undefined在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
~undefined免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
~undefined研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
~undefined缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
~undefined注射器混合法
-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
~undefined优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
~undefined缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
~undefined快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
-每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
~undefined优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
~undefined判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
~undefined常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
~undefined一般采用多点注射方法
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
~undefined几点说明：
-大动物一般不用腹腔注射
-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
~undefined次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
-首次注射后，10～15天再加强注射；
-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
~undefined间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
~undefined初次免疫
-用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
~undefined两周后，加强免疫
-将50～200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
~undefined抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
~undefined一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50g；
-末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
~undefined初次免疫
-用10～100g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
~undefined加强免疫
-每隔 7～8天，将10～50g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
~undefined抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
~undefined抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
~undefined免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
~undefined各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
~undefined指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
~undefined优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
~undefined将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
~undefined将1％agar 融化后，置56℃水浴。
~undefined在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
~undefined中心孔加5l 抗原样品，周围孔内每孔加5l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
~undefined凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
~undefined观察结果。
抗体效价检测的其它方法
~undefined环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
~undefined对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
~undefined酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
~undefined颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
~undefined心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
~undefined静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
~undefined采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
~undefined血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
~undefined加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
~undefined标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
~undefined免疫组化对组织和细胞标本的要求
-保持所检标本原有的结构、形态；
-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
~undefined免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
~undefined组织标本
-石蜡切片
-冰冻切片
~undefined细胞标本
-组织印片
-细胞培养片(细胞爬片)
-细胞涂片
(一) 石蜡切片
~undefined石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
~undefined石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
~undefined标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
~undefined取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。