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        改良双抗体夹心法 结果帮忙分析一下,感激不尽

        丁香园论坛

        4417
        我现在做elisa,目的是利用此法来检测我样品中蛋白的浓度,我用的是改良的双抗体夹心法,就是包被鼠单抗,加标准品和待测样品,再加兔多抗,再加山羊抗兔的酶标二抗,TMB显色。我现在的问题是摸索单抗和多抗的稀释度,所以就将多抗稀释了三个浓度1:5000,1:10000,1:15000,1:20000,单抗 包被稀释度是1:15000,标准品都是五倍稀释即:25μg/mL , 5μg/mL , 1μg/mL , 0.2μg/mL , 0.04μg/mL 酶标二抗是1:5000
        双波长A450/A650检测得到的结果如下
        麻烦大家帮我分析一下:
        1:5000 1:10000 1:15000 1:20000
        25μg/mL 3.460 3.268 2.922 3.135
        5μg/mL 3.122 3.076 2.900 2.36
        1μg/mL 3.031 1.747 1.280 0.876
        0.2μg/mL 0.299 0.181 0.138 0.103
        0.04μg/mL 0.114 0.081 0.074 0.077
        阴性 0.095 0.078 0.074 0.069
        空白 0.052 0.054 0.054 0.055

        我看很多网友说阳性/阴性>2时,说明单抗和多抗比例最佳,请大家帮我分析一下,我这个多抗浓度用哪个合适?
        我自己认为1:5000 和1:10000浓度过高,因为 5μg/mL时已经达到了上限,说明多抗过量或样品也过量,我不知道我这样理解对不对?我晚上又包被了一块板子,我想是不是我的标准品浓度应该再往下稀释,我计划明天标准品稀释为5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.07(倍比稀释)多抗准备做个1:20000, 1:25000, 1:30000

        大家帮我看看是否合理,怎么改进?
        我先交代下我的具体步骤:
        1. 包被单抗,4°过夜
        2.洗板机洗版5次
        3. 封闭5%小牛血清+PBS-T 37° 水浴 2h
        4. 标准品 37°水浴 1h
        5. 洗板机洗版5次
        6.加多抗 37°水浴 1h(多抗是稀释在封闭液中)
        7. 洗板机洗版5次
        8.酶标二抗(稀释在封闭液中)37°水浴 1h
        9.洗板机洗版5次
        10.TMB室温显色20min,加2M硫酸终止
        11. 检测A450/A650
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