【原创】从用PRIMER premier设计引物到查看您所设计的引物会不会有目的产物，以人的APP基因为例
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从用PRIMER premier设计引物到查看您所设计的引物会不会有目的产物，以人的APP基因为例
1、 打开pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ ，在search的下拉菜单中选择 Gene或者直接打开这个链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene
2、 输入 APP （或者其他的 待测基因名称或者缩写均可，以下均以APP为例）；点GO，出来的结果是各个物种的APP基因，人的排在第一个（一般人[Homo sapiens]，大鼠[Rattus norvegicus]，小鼠[Mus musculus]，都排在前几个。），现在设计人的APP普通或者定量PCR引物，所以选择Homo sapiens，截图如下：这些摘要信息会显示该基因所在染色体具体位置，别名，基因编号等。
3、 点击蓝色的APP字母进入查看具体信息（包括DNA序列和RNA序列等），要人的就点人的：如下图
4、 点击后进入网页，如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/351?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum ， 设计RNA引物可以跳过第5步（DNA序列查看和引物设计）直接看第6步即可。
5、 进入之后往下拖网页，可以看到一个NC-000021.8的黑体字， 左键单击它可以看到第二行是Genbank（会出现三行，第一行是FASTA,中间一行是Genbank,第三行是Graphics，这三种都是核酸序列显示格式而已，通常选择Genbank查看基因组序列，）再左键单击Genbank，即进入到该基因的DNA序列查看网页。（这里显示了该基因DNA长度多少，从多少碱基到多少碱基等信息。）拖到此网页的最下面就可以看到完整的DNA序列。
6、 设计RNA引物，进入之后往下拖网页，可以看到一个NC-000021.8的黑体字，这里显示的是DNA信息，继续往下拖网页，可以看到黑体字 mRNA and Protein(s) 下面列的就是RNA和蛋白信息的链接 如
NM_000484.3 → NP_000475.1 amyloid beta A4 protein isoform a precursor
NM就表示mRNA，NP表示蛋白（Protein），（APP比较特殊，有7份mRNA，大多数基因只有一个mRNA，可能跟它被研究的比较多有关系），这么多也不能一一设计引物了，所以就以第一个mRNA为例，点击（左键单击）NM_000484.3进入它链接的网页，即http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000484.3 ，此时可以看到此条APP的mRNA相关的信息
NCBI Reference Sequence: NM_000484.3
Homo sapiens amyloid beta (A4) precursor protein (APP), transcript variant 1, mRNA
LOCUS NM_000484 3648 bp mRNA linear PRI 13-DEC-2009
DEFINITION Homo sapiens amyloid beta (A4) precursor protein (APP), transcript
variant 1, mRNA.
ACCESSION NM_000484
VERSION NM_000484.3 GI:228008403
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
一直往下拖，到最后可以看到mRNA的序列（途中可以看到gene，exon【外显子，即转录成mRNA的区域】，CDS【编码蛋白的区域】，这些都不用管，可以了解下）拖到最后看到了mRNA的序列，ctrl+C复制此序列，以备放入Primer premier
ORIGIN
1 ggatcagctg actcgcctgg ctctgagccc cgccgccgcg ctcgggctcc gtcagtttcc
61 tcggcagcgg taggcgagag cacgcggagg agcgtgcgcg ggggccccgg gagacggcgg
121 cggtggcggc gcgggcagag caaggacgcg gcggatccca ctcgcacagc agcgcactcg
181 gtgccccgcg cagggtcgcg atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga
241 cggctcgggc gctggaggta cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga
301 ttgccatgtt ctgtggcaga ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt
361 cagatccatc agggaccaaa acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc
421 aagaagtcta ccctgaactg cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca
481 tccagaactg gtgcaagcgg ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc
541 cctaccgctg cttagttggt gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca
601 aattcttaca ccaggagagg atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg
661 ccaaagagac atgcagtgag aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct
721 gcggaattga caagttccga ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg
781 acaatgtgga ttctgctgat gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag
841 acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag
901 tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg
961 tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca
1021 ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagaggtg tgctctgaac
1081 aagccgagac ggggccgtgc cgagcaatga tctcccgctg gtactttgat gtgactgaag
1141 ggaagtgtgc cccattcttt tacggcggat gtggcggcaa ccggaacaac tttgacacag
1201 aagagtactg catggccgtg tgtggcagcg ccatgtccca aagtttactc aagactaccc
1261 aggaacctct tgcccgagat cctgttaaac ttcctacaac agcagccagt acccctgatg
1321 ccgttgacaa gtatctcgag acacctgggg atgagaatga acatgcccat ttccagaaag
1381 ccaaagagag gcttgaggcc aagcaccgag agagaatgtc ccaggtcatg agagaatggg
1441 aagaggcaga acgtcaagca aagaacttgc ctaaagctga taagaaggca gttatccagc
1501 atttccagga gaaagtggaa tctttggaac aggaagcagc caacgagaga cagcagctgg
1561 tggagacaca catggccaga gtggaagcca tgctcaatga ccgccgccgc ctggccctgg
1621 agaactacat caccgctctg caggctgttc ctcctcggcc tcgtcacgtg ttcaatatgc
1681 taaagaagta tgtccgcgca gaacagaagg acagacagca caccctaaag catttcgagc
1741 atgtgcgcat ggtggatccc aagaaagccg ctcagatccg gtcccaggtt atgacacacc
1801 tccgtgtgat ttatgagcgc atgaatcagt ctctctccct gctctacaac gtgcctgcag
1861 tggccgagga gattcaggat gaagttgatg agctgcttca gaaagagcaa aactattcag
1921 atgacgtctt ggccaacatg attagtgaac caaggatcag ttacggaaac gatgctctca
1981 tgccatcttt gaccgaaacg aaaaccaccg tggagctcct tcccgtgaat ggagagttca
2041 gcctggacga tctccagccg tggcattctt ttggggctga ctctgtgcca gccaacacag
2101 aaaacgaagt tgagcctgtt gatgcccgcc ctgctgccga ccgaggactg accactcgac
2161 caggttctgg gttgacaaat atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag
2221 aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag
2281 atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga
2341 cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc attcatcatg
2401 gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc aagatgcagc
2461 agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac tagacccccg
2521 ccacagcagc ctctgaagtt ggacagcaaa accattgctt cactacccat cggtgtccat
2581 ttatagaata atgtgggaag aaacaaaccc gttttatgat ttactcatta tcgccttttg
2641 acagctgtgc tgtaacacaa gtagatgcct gaacttgaat taatccacac atcagtaatg
2701 tattctatct ctctttacat tttggtctct atactacatt attaatgggt tttgtgtact
2761 gtaaagaatt tagctgtatc aaactagtgc atgaatagat tctctcctga ttatttatca
2821 catagcccct tagccagttg tatattattc ttgtggtttg tgacccaatt aagtcctact
2881 ttacatatgc tttaagaatc gatgggggat gcttcatgtg aacgtgggag ttcagctgct
2941 tctcttgcct aagtattcct ttcctgatca ctatgcattt taaagttaaa catttttaag
3001 tatttcagat gctttagaga gatttttttt ccatgactgc attttactgt acagattgct
3061 gcttctgcta tatttgtgat ataggaatta agaggataca cacgtttgtt tcttcgtgcc
3121 tgttttatgt gcacacatta ggcattgaga cttcaagctt ttcttttttt gtccacgtat
3181 ctttgggtct ttgataaaga aaagaatccc tgttcattgt aagcactttt acggggcggg
3241 tggggagggg tgctctgctg gtcttcaatt accaagaatt ctccaaaaca attttctgca
3301 ggatgattgt acagaatcat tgcttatgac atgatcgctt tctacactgt attacataaa
3361 taaattaaat aaaataaccc cgggcaagac ttttctttga aggatgacta cagacattaa
3421 ataatcgaag taattttggg tggggagaag aggcagattc aattttcttt aaccagtctg
3481 aagtttcatt tatgatacaa aagaagatga aaatggaagt ggcaatataa ggggatgagg
3541 aaggcatgcc tggacaaacc cttcttttaa gatgtgtctt caatttgtat aaaatggtgt
3601 tttcatgtaa ataaatacat tcttggagga gcaaaaaaaa aaaaaaaa
//
7、 复制这段序列到Primer premier中，安装并激活Primer premier后，打开Primer premier,在File菜单处点new选择DNA sequence，出现一个空白框，ctrl+V 粘贴刚才复制的序列，在paste oligonucleotide in弹出时选择As is粘贴。粘完后，点击左上角的Primer， 进入后再点search ，
8、 出现对话框如下图 此时可以修改一些参数（列举ABC三条，通常要改的地方）A.在PCR Product Size 这里写70 bp-200 bp（SYBR green法定量PCR引物要求最好产物大小在70 bp-200 bp）；B.Primer Length处修改引物长度，比如改为23加减3；C.Search Mode处点Manual，图片变为
9、 此时可以点OK，生成一系列引物，选择最前面的就可以了，或者点击完Manual后点击其下方的Search Parameters，修改想要的Tm值或者其他参数。比如改Tm值，希望得到的引物温度最低在59.9度，改成下图点OK 回到Search Criteria的界面，再点OK。出现对话框如下， 再点下OK，一系列引物就出来了。 可以选择第一对（评分为91分），看上去挺好的。左键单击，即为选中。关闭此对话框（Search Results），点击Primer Premier软件的菜单栏 Edit处， 下拉菜单中的Copy，即可复制sense primer正向引物5' ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA 3' 和antisense primer反向引物5' CAACACACAAACTCTACCCCTCG 3'。上下游引物分别为21和23bp；产物片段大小为187bp。这样引物设计就完成了一大半了。很简单吧。以此类推，看着改参数即可。你好像没有Primer Premier软件吧（装了软件后还有激活这个软件，具体就是在刚装完的软件处生成一个ID,然后用这个ID在注册机KeyGen中来生成一个激活码，再把这个激活码填入软件那之后点击激活就可以了激活Primer Premier软件了）。
10、 引物设计完了，得验证下引物可行不可行，能不能P出产物，或者说能不能产生一个特异性的条带，此时可以进入这个网站进行ePCR http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch 或者进入BLAST的网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 进行电子PCR也可以 ，做法很简单，就是1.输入上下游引物到对应的空格处，2.然后选择所对应的物种，3.点击send query即可。 ，其他参数我不懂，一般不去动它就可以了，（那个Bisulfite和MSP是针对甲基化的引物搜索用的）
11、 出现了一个搜索结果，都是187bp的产物，这个结果反应了APP是有很多RNA模板的，而且这个引物是可以用的。（普通的基因就只会有一个目的片段，而这个基因有好多份拷贝，来自不同的染色体，这时可以点击ENST00000354192或ENST00000346798或者下面的任何一个这种来看是不是APP基因，可以发现都是APP基因）。
Results of your search
• PCR product(s)
• Matches of forward primer
• Matches of revers primer
PCR product(s)
Forward primer: ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA
Reverse primer: CAACACACAAACTCTACCCCTCG
11 PCR products should be generated.
1. ENST00000354192 (len: 187)
332 ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC AAGTGCAAAT TCTTACACCA
GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC ACCGTCGCCA
AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTG 519
2. ENST00000346798 (len: 187)
567 ATGCCCTT CTCGTTCCTG ACAAGTGCAA ATTCTTACAC
CAGGAGAGGA TGGATGTTTG CGAAACTCAT CTTCACTGGC ACACCGTCGC
CAAAGAGACA TGCAGTGAGA AGAGTACCAA CTTGCATGAC TACGGCATGT
TGCTGCCCTG CGGAATTGAC AAGTTCCGAG GGGTAGAGTT TGTGTGTTG 754
3. ENST00000358918 (len: 187)
567 AT GCCCTTCTCG
TTCCTGACAA GTGCAAATTC TTACACCAGG AGAGGATGGA TGTTTGCGAA
ACTCATCTTC ACTGGCACAC CGTCGCCAAA GAGACATGCA GTGAGAAGAG
TACCAACTTG CATGACTACG GCATGTTGCT GCCCTGCGGA ATTGACAAGT
TCCGAGGGGT AGAGTTTGTG TGTTG 754
4. ENST00000357903 (len: 187)
567 ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC AAGTGCAAAT TCTTACACCA
GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC ACCGTCGCCA
AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTG 754
5. ENST00000359726 (len: 187)
567 A TGCCCTTCTC GTTCCTGACA
AGTGCAAATT CTTACACCAG GAGAGGATGG ATGTTTGCGA AACTCATCTT
CACTGGCACA CCGTCGCCAA AGAGACATGC AGTGAGAAGA GTACCAACTT
GCATGACTAC GGCATGTTGC TGCCCTGCGG AATTGACAAG TTCCGAGGGG
TAGAGTTTGT GTGTTG 754
6. ENST00000348990 (len: 187)
567 ATG CCCTTCTCGT
TCCTGACAAG TGCAAATTCT TACACCAGGA GAGGATGGAT GTTTGCGAAA
CTCATCTTCA CTGGCACACC GTCGCCAAAG AGACATGCAG TGAGAAGAGT
ACCAACTTGC ATGACTACGG CATGTTGCTG CCCTGCGGAA TTGACAAGTT
CCGAGGGGTA GAGTTTGTGT GTTG 754
7. ENST00000448388 (len: 187)
460 ATGC CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT
ACACCAGGAG AGGATGGATG TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG
TCGCCAAAGA GACATGCAGT GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC
ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG
TTG 647
8. ENST00000439274 (len: 187)
399 ATGC
CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT ACACCAGGAG AGGATGGATG
TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG TCGCCAAAGA GACATGCAGT
GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT
TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG TTG 586
9. ENST00000440126 (len: 187)
515 ATG CCCTTCTCGT TCCTGACAAG TGCAAATTCT
TACACCAGGA GAGGATGGAT GTTTGCGAAA CTCATCTTCA CTGGCACACC
GTCGCCAAAG AGACATGCAG TGAGAAGAGT ACCAACTTGC ATGACTACGG
CATGTTGCTG CCCTGCGGAA TTGACAAGTT CCGAGGGGTA GAGTTTGTGT
GTTG 702
10. ENST00000448850 (len: 187)
137 ATGC CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT
ACACCAGGAG AGGATGGATG TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG
TCGCCAAAGA GACATGCAGT GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC
ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG
TTG 324
11. ENST00000355226 (len: 187)
567 ATGCCCT TCTCGTTCCT
GACAAGTGCA AATTCTTACA CCAGGAGAGG ATGGATGTTT GCGAAACTCA
TCTTCACTGG CACACCGTCG CCAAAGAGAC ATGCAGTGAG AAGAGTACCA
ACTTGCATGA CTACGGCATG TTGCTGCCCT GCGGAATTGA CAAGTTCCGA
GGGGTAGAGT TTGTGTGTTG 754
12、 这个时候就可以发送这2条引物给公司去合成了，引物订单格式如下（纯化方式随便选，都可以用，HPLC最贵，ultrapage第二贵，page纯化第三贵，其实都不贵，挺便宜的，这样一对引物也就几十块钱。）
Primer名称 序列(5'to3') 碱基数 分装管数 提拱量(O.D) 纯化方式
qAPP for ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA 21 2 2OD PAGE
qAPP rev CAACACACAAACTCTACCCCTCG 23 2 2OD PAGE
13、 引物来了之后可以用水把它稀释成10uM的浓度（管子上一般写的是加多少ul水后稀释成100uM,但我都把它们稀释成10uM的浓度，因为根本用不到那么高的浓度的引物），然后取上游20ul，下游20ul，加入到160ul的水中，这样引物就变成了1uM的引物对了（我喜欢这样用）.
14、 下面写下PCR的体系和PCR循环条件。cDNA可以稀释10倍或者更多倍，也可以只稀释3-5倍或者不稀释，反正都能做得出来PCR，只是为了不浪费cDNA，完全可以稀释10倍以上（通常稀释10倍后取1ul做定量PCR，在20循环左右的时候荧光信号就可以被检测到，反正我的是这样的，才哥稀释了更多倍，才哥稀释了100倍）
2×Mix （即2×的酶，dNTP，
Mg离子都混好了的那种） 15ul
引物 1uM的引物对 10ul
模板 1：10稀释后的cDNA 1ul
补水 4ul
也可以直接这样，就不用补水了，反正引物多点点没事，而且这样并不多，具体可以参见酶的说明书
2×Mix 15ul
引物 1uM的引物对 14ul
模板 1：10稀释后的cDNA 1ul
针对上面那对引物或者一般的定量PCR引物下面这个条件均适用（只要Tm值接近即可），循环条件为(黑体字部分循环，叫她们教你设下程序就知道了)
95℃ 5min
94℃ 30sec 40cycles
60℃ 30sec
72℃ 30sec
72℃ 5min
14℃ 1min
End
最后，如果还有不明白的地方，就问我好了。我想写的挺清楚的了。
1、 打开pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ ，在search的下拉菜单中选择 Gene或者直接打开这个链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene
2、 输入 APP （或者其他的 待测基因名称或者缩写均可，以下均以APP为例）；点GO，出来的结果是各个物种的APP基因，人的排在第一个（一般人[Homo sapiens]，大鼠[Rattus norvegicus]，小鼠[Mus musculus]，都排在前几个。），现在设计人的APP普通或者定量PCR引物，所以选择Homo sapiens，截图如下：这些摘要信息会显示该基因所在染色体具体位置，别名，基因编号等。
3、 点击蓝色的APP字母进入查看具体信息（包括DNA序列和RNA序列等），要人的就点人的：如下图
4、 点击后进入网页，如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/351?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum ， 设计RNA引物可以跳过第5步（DNA序列查看和引物设计）直接看第6步即可。
5、 进入之后往下拖网页，可以看到一个NC-000021.8的黑体字， 左键单击它可以看到第二行是Genbank（会出现三行，第一行是FASTA,中间一行是Genbank,第三行是Graphics，这三种都是核酸序列显示格式而已，通常选择Genbank查看基因组序列，）再左键单击Genbank，即进入到该基因的DNA序列查看网页。（这里显示了该基因DNA长度多少，从多少碱基到多少碱基等信息。）拖到此网页的最下面就可以看到完整的DNA序列。
6、 设计RNA引物，进入之后往下拖网页，可以看到一个NC-000021.8的黑体字，这里显示的是DNA信息，继续往下拖网页，可以看到黑体字 mRNA and Protein(s) 下面列的就是RNA和蛋白信息的链接 如
NM_000484.3 → NP_000475.1 amyloid beta A4 protein isoform a precursor
NM就表示mRNA，NP表示蛋白（Protein），（APP比较特殊，有7份mRNA，大多数基因只有一个mRNA，可能跟它被研究的比较多有关系），这么多也不能一一设计引物了，所以就以第一个mRNA为例，点击（左键单击）NM_000484.3进入它链接的网页，即http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000484.3 ，此时可以看到此条APP的mRNA相关的信息
NCBI Reference Sequence: NM_000484.3
Homo sapiens amyloid beta (A4) precursor protein (APP), transcript variant 1, mRNA
LOCUS NM_000484 3648 bp mRNA linear PRI 13-DEC-2009
DEFINITION Homo sapiens amyloid beta (A4) precursor protein (APP), transcript
variant 1, mRNA.
ACCESSION NM_000484
VERSION NM_000484.3 GI:228008403
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
一直往下拖，到最后可以看到mRNA的序列（途中可以看到gene，exon【外显子，即转录成mRNA的区域】，CDS【编码蛋白的区域】，这些都不用管，可以了解下）拖到最后看到了mRNA的序列，ctrl+C复制此序列，以备放入Primer premier
ORIGIN
1 ggatcagctg actcgcctgg ctctgagccc cgccgccgcg ctcgggctcc gtcagtttcc
61 tcggcagcgg taggcgagag cacgcggagg agcgtgcgcg ggggccccgg gagacggcgg
121 cggtggcggc gcgggcagag caaggacgcg gcggatccca ctcgcacagc agcgcactcg
181 gtgccccgcg cagggtcgcg atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga
241 cggctcgggc gctggaggta cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga
301 ttgccatgtt ctgtggcaga ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt
361 cagatccatc agggaccaaa acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc
421 aagaagtcta ccctgaactg cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca
481 tccagaactg gtgcaagcgg ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc
541 cctaccgctg cttagttggt gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca
601 aattcttaca ccaggagagg atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg
661 ccaaagagac atgcagtgag aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct
721 gcggaattga caagttccga ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg
781 acaatgtgga ttctgctgat gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag
841 acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag
901 tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg
961 tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca
1021 ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagaggtg tgctctgaac
1081 aagccgagac ggggccgtgc cgagcaatga tctcccgctg gtactttgat gtgactgaag
1141 ggaagtgtgc cccattcttt tacggcggat gtggcggcaa ccggaacaac tttgacacag
1201 aagagtactg catggccgtg tgtggcagcg ccatgtccca aagtttactc aagactaccc
1261 aggaacctct tgcccgagat cctgttaaac ttcctacaac agcagccagt acccctgatg
1321 ccgttgacaa gtatctcgag acacctgggg atgagaatga acatgcccat ttccagaaag
1381 ccaaagagag gcttgaggcc aagcaccgag agagaatgtc ccaggtcatg agagaatggg
1441 aagaggcaga acgtcaagca aagaacttgc ctaaagctga taagaaggca gttatccagc
1501 atttccagga gaaagtggaa tctttggaac aggaagcagc caacgagaga cagcagctgg
1561 tggagacaca catggccaga gtggaagcca tgctcaatga ccgccgccgc ctggccctgg
1621 agaactacat caccgctctg caggctgttc ctcctcggcc tcgtcacgtg ttcaatatgc
1681 taaagaagta tgtccgcgca gaacagaagg acagacagca caccctaaag catttcgagc
1741 atgtgcgcat ggtggatccc aagaaagccg ctcagatccg gtcccaggtt atgacacacc
1801 tccgtgtgat ttatgagcgc atgaatcagt ctctctccct gctctacaac gtgcctgcag
1861 tggccgagga gattcaggat gaagttgatg agctgcttca gaaagagcaa aactattcag
1921 atgacgtctt ggccaacatg attagtgaac caaggatcag ttacggaaac gatgctctca
1981 tgccatcttt gaccgaaacg aaaaccaccg tggagctcct tcccgtgaat ggagagttca
2041 gcctggacga tctccagccg tggcattctt ttggggctga ctctgtgcca gccaacacag
2101 aaaacgaagt tgagcctgtt gatgcccgcc ctgctgccga ccgaggactg accactcgac
2161 caggttctgg gttgacaaat atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag
2221 aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag
2281 atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga
2341 cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc attcatcatg
2401 gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc aagatgcagc
2461 agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac tagacccccg
2521 ccacagcagc ctctgaagtt ggacagcaaa accattgctt cactacccat cggtgtccat
2581 ttatagaata atgtgggaag aaacaaaccc gttttatgat ttactcatta tcgccttttg
2641 acagctgtgc tgtaacacaa gtagatgcct gaacttgaat taatccacac atcagtaatg
2701 tattctatct ctctttacat tttggtctct atactacatt attaatgggt tttgtgtact
2761 gtaaagaatt tagctgtatc aaactagtgc atgaatagat tctctcctga ttatttatca
2821 catagcccct tagccagttg tatattattc ttgtggtttg tgacccaatt aagtcctact
2881 ttacatatgc tttaagaatc gatgggggat gcttcatgtg aacgtgggag ttcagctgct
2941 tctcttgcct aagtattcct ttcctgatca ctatgcattt taaagttaaa catttttaag
3001 tatttcagat gctttagaga gatttttttt ccatgactgc attttactgt acagattgct
3061 gcttctgcta tatttgtgat ataggaatta agaggataca cacgtttgtt tcttcgtgcc
3121 tgttttatgt gcacacatta ggcattgaga cttcaagctt ttcttttttt gtccacgtat
3181 ctttgggtct ttgataaaga aaagaatccc tgttcattgt aagcactttt acggggcggg
3241 tggggagggg tgctctgctg gtcttcaatt accaagaatt ctccaaaaca attttctgca
3301 ggatgattgt acagaatcat tgcttatgac atgatcgctt tctacactgt attacataaa
3361 taaattaaat aaaataaccc cgggcaagac ttttctttga aggatgacta cagacattaa
3421 ataatcgaag taattttggg tggggagaag aggcagattc aattttcttt aaccagtctg
3481 aagtttcatt tatgatacaa aagaagatga aaatggaagt ggcaatataa ggggatgagg
3541 aaggcatgcc tggacaaacc cttcttttaa gatgtgtctt caatttgtat aaaatggtgt
3601 tttcatgtaa ataaatacat tcttggagga gcaaaaaaaa aaaaaaaa
//
7、 复制这段序列到Primer premier中，安装并激活Primer premier后，打开Primer premier,在File菜单处点new选择DNA sequence，出现一个空白框，ctrl+V 粘贴刚才复制的序列，在paste oligonucleotide in弹出时选择As is粘贴。粘完后，点击左上角的Primer， 进入后再点search ，
8、 出现对话框如下图 此时可以修改一些参数（列举ABC三条，通常要改的地方）A.在PCR Product Size 这里写70 bp-200 bp（SYBR green法定量PCR引物要求最好产物大小在70 bp-200 bp）；B.Primer Length处修改引物长度，比如改为23加减3；C.Search Mode处点Manual，图片变为
9、 此时可以点OK，生成一系列引物，选择最前面的就可以了，或者点击完Manual后点击其下方的Search Parameters，修改想要的Tm值或者其他参数。比如改Tm值，希望得到的引物温度最低在59.9度，改成下图点OK 回到Search Criteria的界面，再点OK。出现对话框如下， 再点下OK，一系列引物就出来了。 可以选择第一对（评分为91分），看上去挺好的。左键单击，即为选中。关闭此对话框（Search Results），点击Primer Premier软件的菜单栏 Edit处， 下拉菜单中的Copy，即可复制sense primer正向引物5' ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA 3' 和antisense primer反向引物5' CAACACACAAACTCTACCCCTCG 3'。上下游引物分别为21和23bp；产物片段大小为187bp。这样引物设计就完成了一大半了。很简单吧。以此类推，看着改参数即可。你好像没有Primer Premier软件吧（装了软件后还有激活这个软件，具体就是在刚装完的软件处生成一个ID,然后用这个ID在注册机KeyGen中来生成一个激活码，再把这个激活码填入软件那之后点击激活就可以了激活Primer Premier软件了）。
10、 引物设计完了，得验证下引物可行不可行，能不能P出产物，或者说能不能产生一个特异性的条带，此时可以进入这个网站进行ePCR http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch 或者进入BLAST的网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 进行电子PCR也可以 ，做法很简单，就是1.输入上下游引物到对应的空格处，2.然后选择所对应的物种，3.点击send query即可。 ，其他参数我不懂，一般不去动它就可以了，（那个Bisulfite和MSP是针对甲基化的引物搜索用的）
11、 出现了一个搜索结果，都是187bp的产物，这个结果反应了APP是有很多RNA模板的，而且这个引物是可以用的。（普通的基因就只会有一个目的片段，而这个基因有好多份拷贝，来自不同的染色体，这时可以点击ENST00000354192或ENST00000346798或者下面的任何一个这种来看是不是APP基因，可以发现都是APP基因）。
Results of your search
• PCR product(s)
• Matches of forward primer
• Matches of revers primer
PCR product(s)
Forward primer: ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA
Reverse primer: CAACACACAAACTCTACCCCTCG
11 PCR products should be generated.
1. ENST00000354192 (len: 187)
332 ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC AAGTGCAAAT TCTTACACCA
GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC ACCGTCGCCA
AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTG 519
2. ENST00000346798 (len: 187)
567 ATGCCCTT CTCGTTCCTG ACAAGTGCAA ATTCTTACAC
CAGGAGAGGA TGGATGTTTG CGAAACTCAT CTTCACTGGC ACACCGTCGC
CAAAGAGACA TGCAGTGAGA AGAGTACCAA CTTGCATGAC TACGGCATGT
TGCTGCCCTG CGGAATTGAC AAGTTCCGAG GGGTAGAGTT TGTGTGTTG 754
3. ENST00000358918 (len: 187)
567 AT GCCCTTCTCG
TTCCTGACAA GTGCAAATTC TTACACCAGG AGAGGATGGA TGTTTGCGAA
ACTCATCTTC ACTGGCACAC CGTCGCCAAA GAGACATGCA GTGAGAAGAG
TACCAACTTG CATGACTACG GCATGTTGCT GCCCTGCGGA ATTGACAAGT
TCCGAGGGGT AGAGTTTGTG TGTTG 754
4. ENST00000357903 (len: 187)
567 ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC AAGTGCAAAT TCTTACACCA
GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC ACCGTCGCCA
AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTG 754
5. ENST00000359726 (len: 187)
567 A TGCCCTTCTC GTTCCTGACA
AGTGCAAATT CTTACACCAG GAGAGGATGG ATGTTTGCGA AACTCATCTT
CACTGGCACA CCGTCGCCAA AGAGACATGC AGTGAGAAGA GTACCAACTT
GCATGACTAC GGCATGTTGC TGCCCTGCGG AATTGACAAG TTCCGAGGGG
TAGAGTTTGT GTGTTG 754
6. ENST00000348990 (len: 187)
567 ATG CCCTTCTCGT
TCCTGACAAG TGCAAATTCT TACACCAGGA GAGGATGGAT GTTTGCGAAA
CTCATCTTCA CTGGCACACC GTCGCCAAAG AGACATGCAG TGAGAAGAGT
ACCAACTTGC ATGACTACGG CATGTTGCTG CCCTGCGGAA TTGACAAGTT
CCGAGGGGTA GAGTTTGTGT GTTG 754
7. ENST00000448388 (len: 187)
460 ATGC CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT
ACACCAGGAG AGGATGGATG TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG
TCGCCAAAGA GACATGCAGT GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC
ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG
TTG 647
8. ENST00000439274 (len: 187)
399 ATGC
CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT ACACCAGGAG AGGATGGATG
TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG TCGCCAAAGA GACATGCAGT
GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT
TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG TTG 586
9. ENST00000440126 (len: 187)
515 ATG CCCTTCTCGT TCCTGACAAG TGCAAATTCT
TACACCAGGA GAGGATGGAT GTTTGCGAAA CTCATCTTCA CTGGCACACC
GTCGCCAAAG AGACATGCAG TGAGAAGAGT ACCAACTTGC ATGACTACGG
CATGTTGCTG CCCTGCGGAA TTGACAAGTT CCGAGGGGTA GAGTTTGTGT
GTTG 702
10. ENST00000448850 (len: 187)
137 ATGC CCTTCTCGTT CCTGACAAGT GCAAATTCTT
ACACCAGGAG AGGATGGATG TTTGCGAAAC TCATCTTCAC TGGCACACCG
TCGCCAAAGA GACATGCAGT GAGAAGAGTA CCAACTTGCA TGACTACGGC
ATGTTGCTGC CCTGCGGAAT TGACAAGTTC CGAGGGGTAG AGTTTGTGTG
TTG 324
11. ENST00000355226 (len: 187)
567 ATGCCCT TCTCGTTCCT
GACAAGTGCA AATTCTTACA CCAGGAGAGG ATGGATGTTT GCGAAACTCA
TCTTCACTGG CACACCGTCG CCAAAGAGAC ATGCAGTGAG AAGAGTACCA
ACTTGCATGA CTACGGCATG TTGCTGCCCT GCGGAATTGA CAAGTTCCGA
GGGGTAGAGT TTGTGTGTTG 754
12、 这个时候就可以发送这2条引物给公司去合成了，引物订单格式如下（纯化方式随便选，都可以用，HPLC最贵，ultrapage第二贵，page纯化第三贵，其实都不贵，挺便宜的，这样一对引物也就几十块钱。）
Primer名称 序列(5'to3') 碱基数 分装管数 提拱量(O.D) 纯化方式
qAPP for ATGCCCTTCTCGTTCCTGACA 21 2 2OD PAGE
qAPP rev CAACACACAAACTCTACCCCTCG 23 2 2OD PAGE
13、 引物来了之后可以用水把它稀释成10uM的浓度（管子上一般写的是加多少ul水后稀释成100uM,但我都把它们稀释成10uM的浓度，因为根本用不到那么高的浓度的引物），然后取上游20ul，下游20ul，加入到160ul的水中，这样引物就变成了1uM的引物对了（我喜欢这样用）.
14、 下面写下PCR的体系和PCR循环条件。cDNA可以稀释10倍或者更多倍，也可以只稀释3-5倍或者不稀释，反正都能做得出来PCR，只是为了不浪费cDNA，完全可以稀释10倍以上（通常稀释10倍后取1ul做定量PCR，在20循环左右的时候荧光信号就可以被检测到，反正我的是这样的，才哥稀释了更多倍，才哥稀释了100倍）
2×Mix （即2×的酶，dNTP，
Mg离子都混好了的那种） 15ul
引物 1uM的引物对 10ul
模板 1：10稀释后的cDNA 1ul
补水 4ul
也可以直接这样，就不用补水了，反正引物多点点没事，而且这样并不多，具体可以参见酶的说明书
2×Mix 15ul
引物 1uM的引物对 14ul
模板 1：10稀释后的cDNA 1ul
针对上面那对引物或者一般的定量PCR引物下面这个条件均适用（只要Tm值接近即可），循环条件为(黑体字部分循环，叫她们教你设下程序就知道了)
95℃ 5min
94℃ 30sec 40cycles
60℃ 30sec
72℃ 30sec
72℃ 5min
14℃ 1min
End
最后，如果还有不明白的地方，就问我好了。我想写的挺清楚的了。
