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        [分享]Blastn之引物序列验证篇

        丁香园论坛

        2406
        先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列,可以通过全文(如最先发现该基因的文章),全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER,在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后,点击右边的“Links”,再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。

        文献中的引物最好先验证其序列正确,并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证,既可知道序列是否正确,也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。

        如果仅仅是为了验证引物序列是否正确(仅适合于基于完全匹配原则设计的引物),也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索,具体方法为:

        1. 打开Blast,点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”

        2. 等新页面完全显示后,将引物序列直接copy到“Search”框(没有必要将下游引物序列转换成其互补链),下面3种方法都可以(我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别,没仔细比较过哦!)
         (1)直接拷贝上游引物序列,然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
         (2)直接拷贝上游引物序列,在上游引物序列后加一空格,然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
         (3)直接拷贝上游引物序列,换行,然后直接拷贝下游引物序列

        注意:记住上、下游引物的长度,如上游引物为19bp、下游引物为18bp,这在查看Blast结果时有用。

        3. 点击“BLAST!”,新页面完全出来以后,点击“Format!”。

        4. 结果完全出来后,查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因,其他的就不用考虑了。当然,如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补,那就可能是19-37或18-37。

        如果有,那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物,除了要用Blast验证其序列是否正确外,还是应该用软件分析分析到底引物好不好。
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