aladdin™ 488 Caspase-3 活细胞分析试剂

aladdin 488 Caspase-3活细胞分析试剂盒包含aladdin 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3抑制剂。aladdin 488 Caspase-3 Substrate为基于Caspase-3活力检测细胞凋亡提供了有效的工具，适用于荧光显微术和流式细胞术。相比其他基于（FLICA）分析的Caspase的荧光底物或荧光抑制剂，aladdin 488 Caspase-3 Substrate检测Caspase-3活性的同时不会抑制完整细胞的凋亡过程。Substrate由耦合Caspase-3 DEVD识别序列的荧光DNA 染料组成。Substrate最初无荧光，穿过细胞膜进入细胞质。在凋亡细胞中，Caspase-3剪切Substrate，释放高亲和性的DNA染色，这种染料迁移到细胞核标记DNA并发出明亮的绿色荧光。因此，aladdin 488 Caspase-3 Substrate是双功能的，既可以检测Caspase-3活性，又可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。aladdin 488染色可以甲醛固定并兼容后续免疫染色实验。

产品参数：

aladdin 488：Ex/Em = 500/530 nm (with DNA)

组分：

注意事项：

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 细胞可以用终浓度为1 μM的Hoechst 33342染料共同染色，使细胞核产生蓝色荧光染色（Ex/Em = 346/460 nm）。

3. aladdin 488 染色可以被甲醛固定，但与甲醇固定不兼容。

4. 甲醛固定的aladdin 488染色细胞可以用0.1% TritonX-100处理后进行后续染色，但处理后的染色的亮度可能会减弱。

5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

应用范围：

Caspase 3 kit、细胞凋亡检测

使用方法：

1. 实验优化 下面提供的实验步骤根据终点法检测制度。 aladdin 488 Substrate 也可以进行细胞长时间孵育课程研究。细胞密度、 底物浓度和抑制剂浓度可能需要优化。最佳底物浓度可能在 1-10 μM 之间。细胞可以在培养基、PBS 或其他您所选择的缓冲 液中孵育底物。对于贴壁细胞，我们建议更换新鲜含有底物的培养基，以防背景的不均一性。底物孵育后换液或洗涤细胞的 操作是自由选择的。

2. 对照 我们建议您设定以下对照：

A. 阴性对照：不诱导凋亡的细胞； 

B. 阳性对照：诱导凋亡的细胞； 

C. 抑制剂对照：诱导细胞凋亡同时（或提前 10-30 min）孵育 Caspase-3/7 抑制剂，最后再添加  aladdin 488 Caspase-3 底 物。 

3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照 试剂盒中的 Caspase-3/7 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 可以用来确认 Caspase-3/7 依赖于  aladdin 488 的荧光信号。对于抑制 剂对照，抑制剂的终浓度应该至少是底物浓度的 2 倍（例如当使用 5 μM  aladdin 488 底物时，Ac-DEVD-CHO 浓度为 10 μM）。添加底物前在室温下孵育 Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后，孵育液中继续保留抑制剂。Ac-DEVD-CHO 是可 逆的竞争性抑制剂。在某些细胞类型，有效的 Caspase-3/7 抑制剂需要使用不可逆的抑制剂，如 Z-DEVD-FMK，或需要在凋 亡诱导之前或诱导过程中添加抑制剂。  

4. 流式细胞术 

（1）选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。 

（2）贴壁细胞，执行  aladdin 488 Caspase-3 实验前先用胰蛋白酶或其他方法消化细胞。 

（3）用培养基或缓冲液重悬细胞，使细胞密度为 106个/mL 

（4）吸取 0.2 mL 细胞悬液至流式细胞试管。 

（5）抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照）。 

（6）200 μL 细胞悬液中加入 5 μL 0.2 mM 的 Substrate 并立即混匀使底物浓度为 5 μM。不同细胞的最佳底物浓度可能不同， 需分析优化。 

（7）室温避光孵育细胞 15-30 min。 

（8）加入 300 μL 培养基或 PBS，流式细胞仪分析。检测绿色荧光的通道（Ex/Em = 485/515 nm）。 

5. 荧光显微镜 

（1）选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。 

（2）抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照）。 

（3）用含有 5 μM Substrate 的新鲜培养基或 PBS 对细胞进行换液（见上文 1. 实验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底 物一同孵育。 

（4）室温下孵育细胞 30 min 或更长时间。 

（5）细胞可以在含有 Substrate 的培养基中直接观察。对于终点分析法，PBS 清洗细胞，荧光显微镜观察细胞，使用观察绿 色荧光的滤片（Ex/Em = 485/515 nm）。 

6. 荧光酶标仪 

（1）贴壁细胞生长在黑色 96 孔板中；悬浮细胞，调整密至 106个/mL，0.2 mL 细胞悬液分装到一孔。 

（2）选择合适的方法诱导细胞凋亡，未经处理的细胞样本作为对照。 注：细胞可能在管或瓶中处理，然后转移到 96 孔检测板。 

（3）抑制剂对照样本，用 Ac-DEVD-CHO 处理细胞（见上文 3. Ac-DEVD-CHO Caspase-3 抑制剂对照）。 

（4）对于悬浮细胞，直接添加 Substrate 混匀。对于贴壁细胞，用含有 5 μM Substrate 的新鲜培养基或 PBS 对细胞进行换液 （见上文 1. 实验优化）。对于抑制剂对照组，抑制剂与底物一同孵育。

（5）细胞可以在含有 Substrate 的培养基中直接观察。 

（6）对于悬浮细胞，轻轻摇晃重悬细胞。荧光酶标仪设置激发波长 488 nm 和发射波长 520 nm。建议贴壁细胞使用底部采 集方式。贴壁细胞密度的变化可能导致不准确的读数。