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        请教各位大侠。。。(有关膜蛋白提取的一些问题)

        丁香园论坛

        1869
        2004-02-23 19:35 yxiangmind在资料区提到:
        分离细胞膜蛋白的方法:
        1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中,于室温与液氮罐中反复冻融2次。
        2 5000转4度离心,驱除核及未裂解的细胞。
        3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
        4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,分装后-20度保存备用。
        buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
        buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
        buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

        分离细胞膜蛋白的方法:
        1)细胞放在冰上,去除上清,用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
        2)加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
        3)刮下单层细胞,4度下10 000g 5min离心
        4)溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相,然后37度下2 000g离心5min
        5)收集水相留作分析
        6)用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀,冰浴2min后加温,在按步骤6再次离心
        7)按步骤8再次抽提去污剂相,用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
        8)用等量的buffer A分别稀释水相与去污相,并进行免疫沉淀实验
        试剂:
        1)2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl(pH7。5)、蛋白酶抑制剂
        2)缓冲液A(含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
        3)buffer C
        10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
        150mmol/L NaCl
        5mmol/L EDTA(PH7.5)

        分离细胞膜蛋白的方法:
        7M urea
        2M thiourea
        4%chaps
        2.5%sb3-10
        1000000个细胞,可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
        4度高速低温离心30min。
        取上清-20保存。

        请问yxiangmind和各位大侠,上述方法中用的各种试剂是哪些生产商提供?这三种方法哪种收集膜蛋白比较完全?还有其他收集膜蛋白的好方法吗?
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