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        【求助】G蛋白偶联受体定位错误

        丁香园论坛

        1765
        大家好。
        最近在做建一个高表达某G蛋白偶联受体的CHO细胞株,载体是pEGFP-C1。
        稳定筛选后,细胞的荧光表达很好。
        但奇怪的问题是,该受体定位出现了问题。原本该定位在膜的G蛋白偶联受体,现在基本上呈全细胞分布,而且核尤其亮。百思不得其解。
        请各位战友指点。
        附图为该细胞的Confocal图,没有染核。
        多谢大家啦!
        呵呵,你的confocal照的效果很不好呀。不过确实可以看到其定位主要在核内。反而膜上基本看不到。

        我觉得比较有可能的原因是G蛋白与GFP的组合改变了G蛋白的结构,从而影响G蛋白的胞内定位。

        或者是PEGFP-C1质粒多克隆位点在GFP的下游,所以表达出来的GFP是在目的蛋白的N端,这有可能影响它的膜定位序列。可以试一下PEGFP-N1的载体,让GFP表达在目的蛋白的C端,可能会好一点。
        谢谢楼上的指点。
        还是有个问题不太明白。
        如果这个G蛋白定位错误了,为什么细胞没有发现把它降解呢,反而还让它继续存在,而且奇怪的是还能够入核。我的这个G蛋白分子量是44kd,也没有核定位序列,它怎么进去核的呢?
        另外,有一篇国内文献报道,也是用EGFP-C1连的这个目的蛋白,也是转的CHO,就转成功了。不知道是不是我们的CHO有微小差别?还是概率事件呢?
        rebeccagold wrote:
        谢谢楼上的指点。
        还是有个问题不太明白。
        如果这个G蛋白定位错误了,为什么细胞没有发现把它降解呢,反而还让它继续存在,而且奇怪的是还能够入核。我的这个G蛋白分子量是44kd,也没有核定位序列,它怎么进去核的呢?

        我记得有些蛋白进核并不需要NLS,而是由其他蛋白协同进去的。至于为什么没有降解,这个可能性就多了,我们过量表达的蛋白细胞也一样没能降解掉呀,细胞也忙不过来呀。
        哈哈,谢谢楼上的建议。
        我下周再最后试试功能实验,如果不行我就放弃它了。

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        【求助】G蛋白偶联受体定位错误

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