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        【求助】异曲同工不同妙

        丁香园论坛

        1156
        A能上调B基因,针对A基因设计了两条shRNA(1 和 2,分别针对ORF 和3'UTR ),都能有效敲低A基因(qpcr结果,引物扩增的是orf区),那么B基因理应都下调, 但是结果却只发现shRNA1转染的细胞B基因下调,shRNA2转染的细胞中没有变化。有经验的战友帮忙分析一下吧!
        机体是一个有缓冲能力的机体,不是说这个变化就一定能够引起另外一个变化,就如我们的血液一样,喝点醋不会说血液就成酸性了。A能上调B基因,那么A基因对B基因是主要调节还是次要调节是一个主要的问题,还有一个问题就是一个基因的表达情况也跟很多因素相关的,比如说是转录少了,但是是不是其降解也少了呢?蛋白水平变化能不能相互验证?
        同意楼上的观点。现在我正等待抗体做蛋白水平的检测。
        再明确一下,A能上调B基因是在转录水平的调节。我认为我现在主要要分析的是为什么两个不同的shRNA作用不同,我对ncRNA认识不多,会不会与此有关?
        zhujoker wrote:
        机体是一个有缓冲能力的机体,不是说这个变化就一定能够引起另外一个变化,就如我们的血液一样,喝点醋不会说血液就成酸性了。A能上调B基因,那么A基因对B基因是主要调节还是次要调节是一个主要的问题,还有一个问题就是一个基因的表达情况也跟很多因素相关的,比如说是转录少了,但是是不是其降解也少了呢?蛋白水平变化能不能相互验证?


        楼主遇到的现象,是一个很有趣的现象。

        可以探究两个问题:1、qPCR结果是否真实地反映了A基因RNA水平?2、A基因的蛋白水平是否降低?

        对于1,我们是否有更多的技术手段检测RNA水平?如果野生型的RNA水平较高,那么是否可以使用Northern Blot检测一下?

        对于2,如果两种方法都引起了RNA水平的降低,蛋白水平是否有同样水平地降低了?如果两种方法引起了相同程度的RNA水平的下降,蛋白水平的降幅却有很大的不同,那么这样现象的背后是什么?
        是否还需要考虑shRNA的脱靶效应?
        是否有可能A基因的下调本身对B基因的影响不明显,而shRNA1与B基因存在一定程度的互补,从而被下调,而shRNA2对B基因没影响呢??
        至少从序列上排除脱靶的可能!
        1,qPCR结果做了几次?如果仅1次不是很可信。并且最好有Western的结果证明两对shRNA都能有效的下调A蛋白,并用Western检测B蛋白的表达情况。
        2,再做两对针对A基因得shRNA,看看是否一致。
        3,进行Rescue实验。
        你的qrcp针对的是orf,1针对的也是orf,但是2针对的是3`UTR啊。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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