• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        610A 采用 CytoFLEX 流式细胞仪上的紫光侧向散射光,有利于进行亚微颗粒分析和计数

        贝克曼库尔特

        3659

        背景和目标

        基于 FCM 的纳米颗粒(SMP)检测需要特殊的散射光参数设置。该参数的设置和标准化可以用微球作为 QC 工具实现。

        目标:采用流式细胞仪 (FCMr) 对 SMP 进行分析和计数。

        ● 采用微球对最有用的散射参数(FSC 或 SSC)进行测定

        ● 采用先前的标准化设置(1、2)对其标准化效果进行测试

        ● 对比蓝光和紫光 SSC 的散射灵敏度和分辨率

        ● 确认采用质控微球检测散射分辨率得到的增益值,是否会使检测细胞源微颗粒(MP ,亦称为 EV)具有较高灵敏度检测出现灵敏度增益值。

        ● 测试体积法绝对计数。

        方法

        质控微球:带荧光的大小校准过的聚苯乙烯珠混合物(1、2)。Mgx + FSC:100 nm – 300 nm – 500 nm – 900 nm 微球, 适用于以 FSC 触发检测微颗粒的 FCMr(例如,具有 W² 的 B.C.Gallios/Navios、Astrios、带 PMT-FSC 的 BD FACS-SORP、Influx)。

        Mgx + SSC:160 nm – 200 nm – 240 nm - 500 nm 微 球,适用于以 SSC 触发检测微颗粒的 FCMr(其他荧光微球, 例如,B.D.FACS & LSR、Apogee A50、Stratedigm、MacsQuant、… 1)。

        Gigamix = 两种 Mgx+ 的 v/v 混合物。其他荧光 75 nm 微球。

        细胞源的微颗粒:无血小板血浆中的 PMP (CD41/AnnV)(正 常 供 体);TF+ MP (SBTF1-PE/AnnV-F) & EPC-MP (CD59-PE/AnnV-F),从 BxPC3 胰腺癌细胞和血管内皮祖细胞培养液中纯化并提取出来。

        结果

        1. CytoFLEX 采用 SSC 而非 FSC 标准化策略 (C & D vs G)

        2. Violet SSC → 对微球 < 200 nm 和低背景噪声的分辨率率提高 (D)。vSSC 阈值较低,可以适用于低于 75 nm 的微球。(E、F)。

        3. SSC 或 vSSC 使用阈值值为 170 nm 的 SSC 标准化设置 (G),以及 FSC 使用阈值为 300 nm 的设置 (F) ,获得相似 PMP 计数。 CytoFLEX vSSC 截断值为 100 nm →PMP 计数值较高 (G)。

        4. 降低 vSSC 阈值 → MP-TF 和 EPC-MP 计数高于实际标准(K、L)。

        结论

        1. Megamix-Plus 和 Gigamix 是非常有用的、评估新 FCMr 的质控工具。

        2. 采用 CytoFLEX 时,可以通过 SSC 488 进行 SMP 分析, 但最佳方式是采用 SSC 405 (vSSC)。

        3. VSSC 参数对 75nm 和 100nm 的微球分辨率很高。

        4. 当 vSSC 阈值小于等于 100 nm 时,可对 MP 样品进行分析。

        5. 较低 SSC 触发阈值 →更多 MP(参见各种类型)

        采用体积法计数可以获取令人满意的数据(摘自摘要的新数据 #)

        A) 散射光信号触发触发:FSC 或 SSC ?

        采用两组 FCMr 进行 SMP 分析:有些使用 FSC 时表现最佳, 而其他一些则在使用 SSC 时分辨率更佳(有些则同时具备这两项优势,1)

        相同 MP(例如,PMP 子集)位于 FSC 和 SSC 的不同位置。塑料微球是非常有用的质控工具,能够以可再现的方式设置 FCMr,但是无法提供 MP 的绝对大小信息(取决于折射率)。

        B) SMP 仪器评估以及质控

        1. 仪器是否在标准化条件下运行?

        2. 哪一项为优选散射参数?
        FSC 或 SSC ?→ 遵照右侧的组织结构图 (从 1 补充物料开始)。确认 FCMr 是否适合使用标准化条件后:

        参考文献:

        1.Poncelet P, Cytometry A, 2016 ; 89: 148-58.

        2.Poncelet P, Transfusion & Apheresis Science, 2015, 53: 110-126.

        C) 用蓝光对 CytoFLEX 进行初始质控

        1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix

        2. → 蓝光 SSC 可以接受(非最佳)

        3. → FSC 不可接受 (S.I. 500 –300 nm << 3.0)

        4. 转至蓝光 SSC 触发,约 170 nm(标准)

        5. 过滤后的水进样操作:约为 10,000 events/s,且可接受丢弃率约为 10%。

        6. Violet-SSC → MP 分析灵敏度高于蓝色 SSC ?→

        D) 用紫光对 CytoFLEX 进行二次质控

        1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix

        2. → 紫光 SSC:300 nm 以下时,分辨率较高

        3. 转至 vSSC 触发,约 170 nm(标准)

        过滤后的水进样操作:< 10 events/s,丢弃率 < 1%。

        E) CytoFLEX vSSC 可分辨 75 nm 微球

        1. FITC 荧光通道信号触发触发 + Gigamix

        2. 加入荧光 75 nm 微球

        3. 75nm& 100 nm 微球间距较大

        4. # 来自蓝光 SSC:75 nm ~ 100 nm。

        5. 注意原始 1:数使用(B 从.C. Kaluza v1.5 重新处理获自 CytoFLEX

        6. 注使意用 2:CytoFLEX 日常质控在 vSSC 设置中不适用!→ Gigamix 进行 SMP 应用的质控操作。

        F) CytoFLEX vSSC → 触 发<75 nm-eq.

        1. vSSC 触发 & Gigamix + 75nm µS

        2. 阈值低于 75nm 微球

        3. 使用 H2O 作为样本时可接受背景噪声最大。

        4. 在 vSSC(峰值 < 75 nm)中的背景噪声事件率要比蓝光 SSC(峰值约为 100 nm)的低很多。

        5. 75nm 与 100 nm 微球之间峰距宽 → 高分辨率。

        6. 低于 170 nm 的标准化策略有待创建

        G) 在 Gallios 上进行标准化 PMP 计数

        1. vSSC 触发 & Gigamix + 75nm µS

        2. 阈值低于 75nm 微球

        3. 使用 H2O 作为样本时可接受背景噪声最大。

        4. 在 vSSC(峰值 < 75 nm)中的背景噪声事件率要比蓝光 SSC(峰值约为 100 nm)的低很多。

        5. 75nm 与 100 nm 微球之间峰距宽 → 高分辨率。

        6. 低于 170 nm 的标准化策略有待创建

        H) CytoFLEX 上是否存在标准化选项?

        对血浆中的 PMP 进行标准化计数的策略。CytoFLEX,带 vSSC。

        1. 分析 Gigamix 微球(FL1 触发)

        2. vSSC 阈值设为 0.1 µm

        3. 在各个水平创建 SSC & vSSC 门,例如,220(« 较大 PMP »)、170(标准)以及 100 nm(< 标准)。

        4. 定位 MP- 计数微球

        5. 运行已染色的 PFP (CD41-PE/AnnV-F) + 阴性对照品(未显示)

        6. 对 PS+PMP 与 MP 计数微球进行计数

        7. 标准 170 nm 阈值将提供在 SSC 和 vSSC 上提供相似 PMP 计数

        8.→ 100 nm 处 PMP 计数大约 2 倍以上

        I) CytoFLEX 与 Gallios:计数标准化

        1. Gallios:FSC 使用阈值值为 300 nm 设置 (F)

        2. CytoFLEX:vSSC 作为触发信号触发,并设置阈值在 170 nm 处 (G)

        3. → 可对比的 PMP 计数值

        I b) CytoFLEX,带自动采样器:试管 vs µP

        1. CytoFLEX 可采用试管或微板 (µP) 两种采样方式→对比试管(橙色)与 µP(蓝色)中的 PMP 计数值

        2. MP- 计数 (3µm) 与 CytoCount (5 µm) 对比

        3. → 微板 PMP 计数值 > 试管计数值 (1 min)

        4. → 运行 5 分钟后数值接近 (?)

        J) 体积法与微球法计数

        1. CytoFLEX 提供体积法计数功能→对比体积法与微球法计数之间的 PMP 计数值。

        2. 采用相同血浆样品,用三种不同条件的 vSSC 阈值条件检测(100nm、160nm & 200 nm)。

        3. → 在相同条件下,对比两种计数方法的 PMP 计数值。~K~Hp~M~Kp~M4._阈值较低时,PMP 计数值较高。

        5.*) 从摘要获取新数据

        K) vSSC 可检测更多 TF+ 肿瘤 MP

        1. 采用 GigaX+ 微球设门。

        2. 标准限值:500nm、220nm、170nm

        3. 新 vSSC 限值:100 & Max (? < 100)

        L) vSSC 可检测更多 EPC-MP

        1. 采用 GigaX+ 微球设门。

        2. 标准限值:500、220、170nm

        3. 新 vSSC 限值:100 & Max (?< 100)

        4. vSSC 阈值 (« Max »)

        5. 复 制 SSC/vSSC 门

        6. 应用于 MP 分析 (FL1xFL2)

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序