PCR产物克隆方法

PCR产物克隆方法
平端连接
　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
粘端连接
　　引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法更为适宜。
　　T4DNA聚合回切产生粘端：如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。
T－vector法
　　TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。
共环消解法
　　最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。
无连接酶亚克隆法(A)无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）
是利用引物5'末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两端分别互补的碱基。两引物的3'端约20-25个核苷酸分别与待扩增DNA两翼互补，5'端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3'端相同的附加序列。由于线性化质粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通过选择各引物的合适5'附加序列与引物3'端定向杂交。 由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后，分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引物，与紧邻5'端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上游引物，与紧邻5'附加序列内侧的质粒（-）链互补。
　　第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复性产物（这种复性产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通过各自3'端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时，重叠的3'端互为此物沿各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的"连接"。然后两管中PCR扩增各进行15-20个循环。这便可产生大量一端管1）或另一端连接有PCR插入片段的质粒。 第二次PCR后将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物，除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异源双链DNA，并各自有一较长的5'或3'悬端，这种长的5'或3'悬端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。
　　尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠直杆菌。一旦进入体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体中为例说明LFS法。
　　这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR时两引物的5'附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成，引物二聚体，一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达1.7kb的基因片段。这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行亚克隆的片段；②适于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目的（如含点突变、缺失或插入等）片段；④在某些情况下，对已构建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适位置；⑤较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。
　　DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。
PCR基础的检测工具的优缺点
　　首先，PCR反应是快速的。整个DNA提取，扩增和检测的过程通常少于6小时，如果反应利用嵌套的引物，过程可能长些。对于一些样本来说，比如来自粪便和表皮，就需要在DNA提取中增加步骤。这样就延长了整个检测的时间到14小时。
　　用购买的核苷酸提取工具就能缩短检测时间，机械进行提取，使PCR方案最优化或使用加快热循环技术。有了优化的样本，快速提取和光循环热循环，整个检测时间能缩短到2小时。但通常是6-8小时。
　　于培养基基础的方法2-5天的时间相比较，这是巨大的进展了。这也比一些需要有精确计算结果的培养基浓缩的抗体检测实验要快。当购买的实用抗体基础的检测工具比PCR基础的方法快时，大部分这样的化验只能用于非常有限的生物体上。
　　第二，PCR不需要培养。这是与PCR基础的检测的速度密切相关的。既然PCR是十分灵敏的（少到10 cfus的样本就能被检测），培养通常是没必要的。大多数最新的实用PCR检测工具需要有选择性的浓缩，特别是当样本包括大量的PCR抑制剂时。用核苷酸提取方法能够避免培养，核苷酸提取方法产生了PCR质量的DNA并且优化了PCR反应。如果在大量样本中检测少量的病原体或者病源有机体在PCR灵敏度的极限以下的情况下，将需要使用培养。在一般情况下，使用培养的情况是很少的，去除了培养的步骤，时间将被节省下来。
　　比节省时间更重要的是，去除了培养，那些难以或不能培养的生物体就可以进行检测。这些生物体包括某种病毒、真菌、厌氧性生物和支原体。
　　第三，PCR的花费合理。与培养或抗体基础的化验相比，PCR基础的诊断是十分经济的。
　　考虑到细菌的培养，有较昂贵的花费。大多数样本为了正确的鉴定需要培养和重复培养。这需要大量的手工时间（加上化验的花费），也增加了污染的危险。
　　作为比较，大多数抗体化验所需的手工时间很少但化验本身很昂贵。
　　PCR反应的成分（引物，酶，dNTPs和缓冲液）的花费比每次化验的花费少40%，而反应的时间包括核苷酸分离，通常在一小时以内。当然这依赖于样本、技术员和用于分离核苷酸的技术。既然PCR所用的时间少，它的花费也少。
　　但是，PCR需要热循环，UV来源和一些类型的图象捕获装置，因此PCR实验室的最初花费是很高的。
　　这里讨论了另外一些在临床领域的PCR使用的基本原理
　　第一， PCR不是抗原基础的。
　　抗体基础的检测工具（ELISA和其他）不仅检测1）直接抗病原体的人类抗体，而且能检测2）病原体上的表面抗原。人类抗体检测工具因此需要免疫反应的存在，以及在正确检测抗原存在之前抗体浓度的测定。在新近感染的情况下，这种测试不能检测针对病原体的人类抗体，可能不能正确反映是否有感染。事实上，被感染的病人，没有充足的时间来提高用于检测的浓度。这是HIV抗体基础检测的通常的问题。由于相同的原因，这种类型的测试对检测无免疫应答患者的病原体存在困难。反过来讲，抗体基础的测试也会给出错误相反的结果。
　　然而抗体基础的检测最大的问题是它不能检测新的病原体亚型，由于表面抗原发生改变，而导致了错误的阴性结果。（PCR基础的检验也可能由于DNA的变化、突变而遇到相似的问题。但PCR基础的检验能够进行设计，使这些错误的阴性结果最小化。）
　　尽管有这些缺点，抗原基础的检测工具是十分重要的检测方法，在大多数情况下比PC
R检测要迅速。
　　第二， 检验易按客户的要求设置，以适合特殊的需要
　　通过简单使用不同的特殊目标引物，工具能迅速设计，用于许多检测。
　　第三， PCR容易使用，是由时间证实的技术
　　通过使用有商业价值的核苷酸提取产物，用于病原体检测的样本能在少于十分钟的时
间内被例行操作。一旦进行操作，样本被加入反应体系中，进入热循环。反应完成后，样
本能被自动系统或凝胶电泳所分析。
　　少数的PCR检测将能完全自动化。仪器将进行所有操作，从样品的准备到分析结果。这样的系统将十分昂贵，可能只能适应制造商的平台。这对大多数临床实验室无吸引力，但当价格下降后，将最终使PCR诊断自动化。