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        原代细胞培养实验

        互联网

        1958
        相关专题

        细胞培养 (Cell Culture)专题:
        http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

        实验目的和要求:
        掌握无菌操作技术。
        了解小鼠解剖操作技术。
        了解原代细胞培养的一般方法与步骤
        了解培养细胞的消化分散。
        了解细胞计数方法。
        了解倒置显微镜的使用。

        实验原理

        原代细胞培养
        是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老,死亡等生命现象。

        实验内容:

        动物的选择:
        选择大约一半足孕时间的胚胎,10-13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞,成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
        每组小鼠胚胎1个

        实验材料:
        每组的超净台中有以下物品:
        1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶;8ml小牛血清(FCS) 1瓶;100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶;PBS (-)1 瓶
        2. 100ml灭菌烧杯2个;
        3、50ml离心筒2个
        4、灭菌培养皿1个,细胞培养瓶1个
        4、1ml ,200μl移液器各1支;枪头盒2个;无菌玻璃搅拌棒1个
        5、细胞计数板1块;
        6、灭好菌的镊子1把,剪刀1把;
        7、酒精灯1台;

        试验操作步骤:
        1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
        a.采用认可的方案处死啮齿动物。
        b.立即在无菌超净台内用70%乙醇擦洗整个动物。
        c.用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
        d.用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宫,置于无菌的培养皿上。
        e.剔除胚胎周围的包膜,将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。
        f.漂洗胚胎,去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

        2)将1-2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中,用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎, 用PBS漂洗。
        3)在无菌状态下,将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25%的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。
        4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。
        5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降,将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中,该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。

        6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中,重复步骤4和5。
        7)离心混合的细胞悬液,1200r/rain,5分钟,弃上清。
        8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞,按步骤7再次离心。
        9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。

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