小鼠药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测
丁香园
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小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测
实验分组：小鼠XX细胞，按下面分组进行药物干预培养，并收集细胞进行免疫沉淀实验。
| 1 | 正常对照组 |
| 2 | 高糖组 |
| 3 | 高糖+E药物 |
| 4 | 高糖+A药物(25μM) |
| 5 | 高糖+A药物(50μM) |
| 6 | 高糖+A药物(100μM) |
| 7 | 高糖+A药物(100μM)+B药物（1mM） |
| 8 | 高糖+C药物(25μM) |
| 9 | 高糖+C药物(50μM) |
| 10 | 高糖+C药物(100μM) |
| 11 | 高糖+C药物(100μM)+B药物（1mM） |
| 12 | 高糖+D药物(25μM) |
| 13 | 高糖+D药物(50μM) |
| 14 | 高糖+D药物(100μM) |
| 15 | 高糖+D药物(100μM)+B药物（1mM） |
免疫沉淀过程
实验试剂：A抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；B抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；Protein A+G Agarose（上海维景生物）
蛋白样品的准备：1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注意事项：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
去除非特异性结合：1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
免疫沉淀：采用A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
Western blot检测
实验试剂：Phosphotyrosine抗体( Millipore, #05-321, 1:500)；Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP(ZYMED, #62-64201,1:40,000-100,000)
实验设备：① 电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；② 电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；③ 电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)；④ NC膜：PIERCE，Catalog#88018；⑤ 滤纸：Whatman,3MM CHR
实验步骤：略
实验结果：目的蛋白检测，取以上沉淀下来蛋白混合液处理后，每孔点样15ul。
注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p-A蛋白 | 19.415 | 79.179 | 81.869 | 64.923 | 64.544 | 38.742 | 76.364 |
| 样本NO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane 8 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- A蛋白 | 66.048 | 38.485 | 24.444 | 41.068 | 50.312 | 57.092 | 42.603 | 94.83 |
| 样本NO | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- B蛋白 | 19.37 | 61.188 | 56.7 | 47.383 | 42.308 | 16.953 | 75.589 |
| 样本NO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane 8 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- B蛋白 | 70.891 | 38.042 | 43.421 | 29.656 | 64.184 | 25.98 | 41.653 | 77.76 |
| 样本NO | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 |
