附录三　全血细胞培养染色技术常用试剂配制

附录三　全血 细胞培养 染色体技术常用 试剂 配制

一、国内实验室应用试剂配制

（一）培养液

（1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节　pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。

（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。

（3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。

　　（4）pH调整液：5%NaHCO ₃ 溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。

（5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌（8磅10min）。

（6）磷酸缓冲液：pH7.4。

　　磷酸氢二钠28.8g(H ₂ O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。

（7）Giemsa染色液：

Giemsa粉剂　　　　　　　　　　　1g

甘油　　　　　　　　　　　　　　66ml

在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。

（二）固定液

（1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。

（2）PBS缓冲液配制：

　　NaCl　　 16g　　 Na ₂ HPO ₄ (12H ₂ O)　　5.65g

　　KCl　　　0.4g 　KH ₂ PO ₄ 0.4g

加双蒸水至1000ml pH7.0。

取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4℃冰箱待用。

　　二、 细胞培养 （Bhatl B和McGee JOD,1990）

1．完全培养基

RPMI　　　　　　　　　　　　 76.0ml

胎牛血清 　　　　　　　　　　20.0ml

植物凝集素　　　　　　　　　　2.0ml

抗生素/抗菌素溶液（100×）　　1.0ml

L-谷氨酰胺（100×）　　　　　1.0ml

　　2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH ₂ O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光（弱光）下操作。

　　3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd）　　按250μg/ml溶解于dH ₂ O中，过滤后分装储存于-20℃。

　　4．Colcemid(Sigma)　　5.0μg/ml溶于dH ₂ O中，过滤后分装储存于-20℃。

　　5．KCl（0.75mol/L）　　溶解560mg于100ml dH ₂ O中，新鲜配制37℃保存。

6．固定剂　　甲醇冰醋酸按3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。

7．缺口平移试剂盒（Amersham和BRL公司）

8．生物素7-dATP(BRL)

9.糖原（BRL）

10．RNA酶A（Sigma）

（1）储备液

称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。

（2）工作液

用储备液按1：100稀释。

11．20×SSC

NaCl　　　　　　　　　　　 175g

柠檬酸三钠 　　　　　　　　88g

　　dH ₂ O 　　　　　　　　　　1000ml

　　固定试剂溶解后，dH ₂ O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。

12．杂交液（高深度，HMmix）

去离子甲酰胺　　　　　　　　　 6.0ml

100×Denhardt’s液　　　　　　1.0ml

50%硫酸葡聚糖　　　　　　　　 2.0ml

　　1%人或鲑精DNA ^※

20×SSC

※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。

该液为高浓度杂交液， 存于4℃。

13．PBT液

BSA　　　　　　　　　 　　5%

Triston X-100/(PBS)　　 0.1%

注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

14．兔抗生物素（α-生物素）单克隆抗体

用PBT液1：100稀释。

该单抗现可从英国Dako公司购得。

15．金（10～20nm）标羊抗兔二抗

用PBT液1：50稀释。

16．银溶液（Janesen）

17.Hoedst 33258（Sigma）

储备液（100×）

Hoedst染料　　　　　　　　　　 5mg

甲醇　　　　　　　　　　　　　 10ml

工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。

（吴康 蔡文琴）