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        细胞转染方法

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        物理方法
        电穿孔(electroporition)
        显微注射(microinjection)
        化学方法
        磷酸钙转染(calcium phosphate transfection)
        脂质体转染(lipofectin transfection)
        DEAE葡聚糖介导转染(DEAE dextran-mediated transfection)

        目前比较常用的方法是脂质体转染,以下我简单介绍一下:
        转染试剂:LipofectamineTM 2000
        质粒DNA:含有目的基因pEGFP-C1质粒DNA
        真核细胞:肿瘤细胞等
        转染目的:蛋白定位和转染效率
        (以转染24孔板为例)
        在转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到80%-90%覆盖。一般要求,24孔培养皿,每孔500ul培养基0.5-2×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数。
        转染当天,加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内,更换500ul无血清无抗生素的DMEM培养液培养2-24h。
        混合A溶液于一个1.5ml离心管中:稀释质粒DNA(0.8ug)于50ul无血清培养基,轻轻混匀。
        混合B溶液于另一个1.5ml离心管中:脂质体lipofectamine试剂(2ul)溶于50ul无血清培养基中混匀,室温孵育5min。
        注意:脂质体在用之前应混匀;质粒DNA/ LipofectamineTM 2000为1:0.5-1:5。
        当B溶液孵育5min后,混合溶液A和B,轻柔混合(不要振荡),室温孵育20min,以便脂质体/DNA混合物形成。
        加入上述100ul A/B混合液于含有细胞的培养基中,前后摇动以便轻轻混匀。37℃,5%CO2培养箱内培养4-6hr。
        4-6h后,用新鲜含血清培养基更换含有转染复合物的不完全培养基,继续培养,18-48 h后测定细胞瞬时表达并进行荧光定位。
        如稳定转染24hr后施加筛选压力,改用含G418的培养基培养

        (责任编辑:大汉昆仑王)

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