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        【共享】免疫组化问题及解决办法

        丁香园论坛

        1458

        免疫组化问题及解决办法
        1、染色过强
        原因 解决办法
        抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度(一般指浓缩性抗
        体),抗体孵育时间:室温1小时或
        4℃过夜
        孵育温度过高,孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃
        DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟,以显微
        镜下观察为准

        2、非特异性背景染色
        原因 解决办法
        操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5
        组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长
        组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
        血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间

        3、染色弱
        原因 解决办法
        抗体浓度过低,孵育时间过短 提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟
        试剂超过有效使用期 及时更换试剂
        操作中,滴加试剂时缓冲液未沥 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
        干,致使试剂稀释 (但防止切片干燥)
        室温太低,低于15℃ 若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵
        育30-60分钟(或4℃冰箱过夜)
        蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟

        4、染色阴性
        原因 解决办法
        操作步骤错误 重新试验,设立阳性对照
        组织中无抗原 设立阳性对照片,以验证实验结果
        一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误

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