免疫组化的经验总结－操作要点和技巧

1． 固定：最好用 4% 的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml ，甲醛 250ml ，冰醋酸 50ml ，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP 液：即高碘酸钠 - 赖氨酸 - 多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2 ．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3 ．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4 ．烤片： 60℃ 30 分钟或 37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5 ．蜡块及切片的保存：最好在 4℃ 保存
6 ．脱片问题： Poly-L-Lysine( 多聚赖氨酸 ) 为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂， 6ml 的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（ APES 和 Poly-L-Lysine ）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在 APES 1 ： 50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟，晾干，即可进行下一步。
7 ．灭活内源性酶： HRP 系统： 3% 双氧水灭活； AP 系统： 3%HAc 灭活。
8 ．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度 ( 不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书 ) 。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9 ．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10 ．抗体稀释：应遵循 “ 现用现配 ” 的原则，对于 PBS 稀释的抗体一定要当天使用。
11 ．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含 1‰ Tween20 的 PBS 洗，特别是在显色之前要多洗。
12 ．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如 PBS ）或 Na2HPO4 的饱和溶液返蓝。
13 ．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

DAB 法 显示过氧化物酶

〔原理〕 过氧化物酶分解 H2O2 的过程中，下面反应不直接发生： AH2 （供氢体） +H2O2 → A （供氢体的氧化物） +2H2O2 实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶 —— 底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。

免疫组化染色步骤（以 ABC 法为例）

溶液的配置 ：

1. 0.1 M PBS 2000ml ： NaCL 18g, NaH₂ PO ₄ ·2H₂ O 0.8g, Na₂ HPO ₄ ·12H₂ O 12g. 共六份

2. 柠檬酸盐缓冲液：

贮存液：0.1M 柠檬酸溶液（A ）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水

0.1M 柠檬酸三钠溶液（B ）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水

工作液： 9ml A 液 +41ml B 液 +450ml 蒸馏水→ 0.01M 柠檬酸盐缓冲液

3. 0.03 % H₂ O₂ - 甲醇：30% H₂ O₂ 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀

4. 20% 甘油： 80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水

5. 稀释抗体： 1 ︰ 300 ， 1 ︰ 400 ， 1 ︰ 600 （临用前配）

6. 酒精的配置

染色步骤：一步法

1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40 ′。

2. 二甲苯Ⅰ， 60 ℃ 20 ′ ( 水浴箱中 ) ，二甲苯Ⅱ，室温 15 ′。

3. 脱水， 100 % →95% →85% →75% 酒精，每级均为3 ′。

4. 蒸馏水冲洗， PBS 5 ′﹡ 1

5. 微波炉修复抗原： 0.01M 柠檬酸盐缓冲液， 99 ℃ 肺 20 ′，心肾 12 ′

6. PBS 3 ′ 3_~K~Hfont~M~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~0~0~0~Kfont~M7._0.03_~7_~Kspan~M_~K~Hspan~M_H~Ksub~M2~K~Hsub~M_O~Ksub~M2~K~Hsub~M_~F_甲醇，室温20 ′

8. PBS 冲洗， PBS 3 ′ 3_，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织） ， PAP Pen 划境线。

9. block solution 封闭抗原，室温 10 ′。

10 . 倾出封闭液 ，不洗，滴加一抗（ 60ul ）， 4 ℃ 过夜 或 37 ℃ 1 ～2h 。

11. PBS 冲洗， 3 ′ 3_。

12. 除去 PBS ，滴加 A 增强剂，室温 25 ′。

13. PBS 冲洗， 3 ′ 3_。

14. 除去 PBS ，滴加 B 剂，室温 35 ′。

15. PBS 冲洗， 3 ′ 3_。同时配置 DAB 显色剂。

16. 除去 PBS ， DAB 显色 10 ′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间 ） 。蒸馏水冲洗。

17. 复染：苏目素均匀 滴加 2 滴， 40 ′′，蒸馏水冲洗， 60 ℃ 温水泡半分钟。

18. 脱水：75% 酒精→85% →95% →100% （3 次），每级3 ′。

19. 透明：二甲苯Ⅰ 3 ′，二甲苯Ⅱ 3 ′。

18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡 ） ， 60 ℃ 0.5h 烘干。

结果：棕褐色反应产物代表抗原 X 的定位。

拍照

1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。

2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉

3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在 250 左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。