ELISA中非特异性显色原因分析

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【摘要】：影响ELISA中非特异性显色的原因很多，如盒特异性、检验标本中含酶标记物的干扰物，操作过程中的问题。本文就这一原因作一简要分析,以便可以通过以上措施把非特异显色降至最低限度，从而提高检测的特异性，并得到更准确、可靠的实验结果。
【关键词】 ELISA 非特异性 显色
酶联免疫吸附试验（ELISA）自1971年自问世以来，以其敏感性高，特异性强，操作简便、安全，而广泛应用于临床诊断，开创了免疫学诊断的新纪元。但同其它免疫诊断方法一样酶免在它的研究、生产及使用中常常会碰到非特异性问题，本文就在实验过程中产生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特异性显色作一分析。
1、试剂盒特异性因素
1、1 固相载体的选择。ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种，以微量滴定板最为常见[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各产品的质量差异很大。因此，在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证，评估。

1、2包被物的纯度。在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中，试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。目前由于技术条件的限制，包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%，所以有些非特异性显色不可避免，只能尽可能提高纯度，提高特异性。目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原。
1、3包被抗体的效价。具有高亲和力和高特异性的包被抗体，是决定试剂特异性的重要方面。
1、4 封闭。是ELISA中重要的一步，目的是封闭固相载体表面尚未被所占据的空隙[2]，减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。
2、检验标本中含有酶标记物的干扰物
2、1内源性干扰物：类风湿因子（RF）、黄疸等，类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应，从而呈现非特异性显色。
黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用辣根过氧化物酶为标记物，就有可能产生非特异性显色。
2、2 外源性干扰物，常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。溶血标本，红细胞溶解破裂，释放出血红素形成，而血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP（辣根过氧化酶）[2]，有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性[3]。如在冰箱中保存过久，其中的IgG可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血标本在采集处理时应小心，在冰箱中保存不易过久。
标本凝集不全时，血清中会残留部分纤维蛋白原，也易造成假阳性。