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        由补体介导的细胞毒试验(Complement Mediated Cytotoxicity Test)

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        补体介导的细胞毒试验(Complement Mediated Cytotoxicity Test)是指特异性抗体与细胞膜上相应抗原 结合后,在补体的参与下,可产生细胞膜损伤,细胞死亡;不带相应抗原的细胞仍然存活.利用染料排斥实验判定淋巴细胞死活状态,活细胞不着色,具有折光性,大小也正常.死细胞着色,体积增大。

        一、实验原理

        带有特异抗原的靶细胞(如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞)与相应抗体结合后,在补体的参与下,引起靶细胞膜 损伤,导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料(例如:伊红-Y、台盼蓝)可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色,故可用于指示死细胞或濒死细胞,而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验,利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原,亦可鉴定抗体的特异性。

        本实验中,Thy-1 抗原是小鼠胸腺T 细胞特异的表面抗原,在体外利用抗小鼠Thy-1 的单克隆 抗体通过补体的协同作用,可杀伤95%以上的胸腺细胞。

        二、实验材料

        1. 解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80~100 目不锈钢网

        2. 试管、lml 吸量管、尖吸管

        3. 载玻片、盖玻片

        4. C57BL/6J 小鼠

        5. 含5%NBS 的冷Hank's 液

        6. 抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)

        7. 补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收,预先测定效价并稀释为最佳稀释度)

        8. 1%伊红-Y 染液

        三、实验方法

        1. 小鼠胸腺细胞悬液的制备:

        将4~6 周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死,取出胸腺放入已加入约4ml冷Hank's液的平皿中,在100 目的不锈钢网上研磨后,过筛,放入试管,离心1000rpm,5 分钟,用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank's液中,配成1×107/ml细胞悬液。

        2. 取试管3 支,标明顺序,依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank's液,放入37℃水浴30 分钟。

        3. 取出后每管加入1%伊红-Y 染液1 滴,混匀,室温放置2 分钟。

        4. 重新混匀后分别在一张载玻片上滴片,加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察,再用高倍镜观察,比较3 管中细胞死活情况。

        四、实验结果

        死细胞呈红色,无光泽且肿胀变大;活细胞不着色、有光泽且形态正常。高倍镜下计数200 个细胞并计算其中死细胞的百分数。计算公式如下:

        五、注意事项

        (1)胸腺细胞制备速度要快,且需在冰浴中进行操作,以保持细胞活力。

        (2)抗Thy-1 的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定。

        (3)细胞对照管死细胞数若超过5%,实验需重新做。

        (4)细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。


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