蛋白质印迹免疫分析（Western Blot Anglysis）

蛋白质印迹免疫分析（Western Blot Anglysis）

【基本原理】

蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级 试剂 —放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联抗免疫球蛋白抗体结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原—抗体—抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。

【器材】
转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套，小尺

【 试剂 】
1．IgG 标准品
2．羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体
3．转移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加三蒸水至1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。
4．Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g，NaCl 29.2g，溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5，然后补加三蒸水至1000ml。
5．漂洗液（TTBS）：TBS液500ml，加Tween20 250ul。
6．封闭液：5%脱脂奶粉。
7．抗体buffer：1.5g BSA溶于50ml TTBS。
8．显色液DAB（3.3-diaminobenzidine，3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml，0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10
μl（临用时现配）。
9．脱色液：甲醇250ml，冰醋酸100ml，加蒸馏水至1000ml。
10．氨基黑染色液（0.1%氨基黑-10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸过滤。
【操作步骤】
一、样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。
二、转移印迹
1．转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏水中10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min 。
2．凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移buffer 中平衡30-60min。
3．按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。
4．开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流0.8mA/cm，室温下转移1h，转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ，然后脱色检测转移效果。
三、免疫染色
1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。
2．TBS洗膜1-2次，10min/次。
3．加HRP标记的抗体，室温1h 。
4．TBS洗3次，10min/次。
5．NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。