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        细菌的接合作用

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        14405

        实验四十七 细菌的接合作用

          一、目的要求

          1.了解细菌接合作用的基本原理。

          2.学习细菌接合实验的基本方法。

          二、基本原理

          细菌的接合是指供体菌与受体菌的完整细胞经直接接触时,供体菌的 DNA分子(包括质粒)传递给受体菌而产生基因重组的现象。营养缺陷型菌株例如Me- Th 或Me Th- 不能在基本培养基中生长,如果将两者混合培养,使其接合而发生基因重组产生了Me Th 菌株,就能在基本培养基上生长,如图Ⅺ-4。根据这一原理培养,很易检出亿万个细菌中出现的重组细菌。

          Me=Methionine,甲硫氨酸; Th=Threonine,苏氨酸。

          三、器材

          供体菌 E.coliA:Me Th-

          受体菌 E.coliB:Me- Th

          完全培养基[胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖培养基(TYEG培养基)],基本培养基(MM培养基),无菌平皿7套,无菌试管1支,盛9ml无菌水的试管5支,1ml无菌吸管6支。

          四、操作步骤

          1.菌悬液制备

          将E.coliA和E.coliB分别接种于TYEG培养液中,37℃温室中培养24小时。取出培养物3 000r/min离心10分钟,再用无菌生理盐水洗涤离心2—3次,分别制成每毫升中约含菌1×108 个的菌悬液。

          2.倒平板

          将TYEG培养基和MM培养基分别溶化,冷至45℃时倒平板。TYEG培养基2个,MM培养基5个,凝固待用。

          3.E.coliA和E.coliB稀释,涂布接种作对照

          用2支1ml的无菌吸管分别吸取1mlE.coliA和1mlE.coliB菌悬液至盛有9ml无菌水并标有“10-1 A”和“10-1 B”的试管中,摇匀。然后用无菌吸管以无菌操作取“10-1 A”试管中的菌悬液各 0.1ml分别加至标有“ TYEGA”和“MMA”平板上,再用另一吸管取“10-1 B”试管中的菌悬液各0.1ml分别加至“TYEGB”和“MMB”琼脂平板上,分别用无菌涂棒涂匀。将以上四平板倒置于30℃温室中培养2—5天,观察结果。

          4. E.coliA和E.coliB混合稀释涂平板(细菌的接合作用)

          (a)E.coliA和E.coliB的混合用2支1ml的无菌吸管分别吸取1mlE.coliA和E.coliB菌悬液至标有“A B”试管中混合,并轻轻摇动混匀。置30℃温室中培养30分钟。

          (b)E.coliA和E.coliB混合液稀释将培养30分钟的混合菌液用1ml无菌吸管吸取1ml至盛有9 ml无菌水并标有“A B 10-1 ”的试管中,摇动使其充分混匀。再用另一支1ml无菌吸管吸取1ml“A B10-1 ”稀释液至第二支盛有9ml无菌水并标有“ A B 10-2 ”的试管中,以此类推,稀释至“A B10-3 ”。

          (c)涂平板用1ml无菌吸管分别吸劝A B10-1 ”、“A B10-2 ”、“A B10-3 ”各0.1ml至标有“MM10-1 A B”、“ MM10-2 A B”、“MM10-3 A B”的基本培养基上。再用3支无菌玻璃涂棒分别将平板表面菌液涂布均匀。倒置于30℃温室中培养2—5天,观察结果。

          E.coliA和E.coliB接合作用操作如图Ⅺ-5所示。

          五、实验报告

          1.结果

          (1)将E.coliA培养物和E.coliB培养物在两种平板上的生长情况记录于下表中。“ ”表示生长;“-”表示不生长。

          (2)计算重组子数数不同稀释度的混合菌液在MM平板上长出的菌落数,并计算每毫升未稀释混合菌液中的重组子菌落数,将所得结果填入下表。

          2.思考题

          (1)结合课堂所学知识,在这个接合实验中,你如何确定涉及到染色体或F质粒的转移?

          (2)E.coliA与E.coliB分别划线接种在TYEG培养基和MM培养基琼脂平板上,经培养后,在哪一种平板上生长并形成菌落,你如何解释这个结果?

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