PCR定量技术--PCR　ELISA

PCR自诞生以来，人们就在努力探索PCR定量的方法。荧光素染色凝胶电泳在PCR最初的一段时间是唯一的检测技术，因此人们在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析，以求实现PCR的相对定量。

　　但是由于普通凝胶电泳检测本身的不特异性，只能进行粗略的相对定量，难以满足人们日益对精确定量的渴望，不过由于普通凝胶电泳光密度分析简捷易行，成本低，目前还是科研还很常用。但是难以满足临床应用的要求。

　　由于固相捕获技术的成熟和应用，特别是酶联免疫吸附试验（ELISA）的成功，给核酸定量提供了一个思路。此后，应用固相捕获的PCR定量技术应运而生。即在PCR扩增以后，在微也板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。被称为PCR－ELISA ：

　　PCR－ELISA原理：

　　首先，使用亲和素包被微孔板，再用生物素标记捕获探针3`端（捕获探针5`端和待检靶序列5`端的一段互补）通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上，制成固相捕获系统。

　　其次，在扩增时，引物用抗原（生物素、地高辛、荧光素酶等）标记，这样扩增产物中就会代有抗原。

　　用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交，靶序列被捕获。再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色。从而实现定量。

　

　　虽然PCR经过长时间的探索，PCR－ELISA逐渐成熟，并有了不同的改进版本，但总的还是没有脱离固相分离、酶标抗体的经典范畴。

　　PCR－ELISA的步骤：

　　1.核酸提取和制备

　　2.进行PCR扩增

　　3.微孔预杂交

　　4.产物杂交

　　5.显色

　　6.检测分析

　　PCR－ELISA的优点：

　　PCR－ELISA相对于凝胶光密度定量，无论是灵敏度、特异性、准确度上都是很大的提高，能满足临床要求。它为PCR提供了第一个严格意义上的定量方法。并且对仪器要求较低。只要有扩增仪和酶标仪就可以进行。

　　PCR－ELISA的不足及消减措施：

　　 1.污染问题严重。PCR－ELISA在扩增之后又要进行ELISA反应，而ELISA是一个开放性的反应，特别是洗板，很容易产生污染引起假阳性。为减小污染，一定要严格分区隔离，以避免污染。同时，使用dUTP与UNG酶也可以在一定程度上减小污染的影响。由于PCR产物都是高浓度的。一般情况下，产物都被扩增至2的20方以上，即使避免了扩增前的污染，但同批样本产物之间的交叉污染可能远远大于ELISA，不能忽视。

　　2.显色定量分析相对于最近的探针荧光分析，无论是灵敏度还是特异性上都有差距。

　　3.操作繁琐，这也是严重制约临床应用的重要因素。

　　注意：PCR－ELISA一定要严格分区，及时进行空间和仪器消毒，严防污染

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