实验80 植物组织培养
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实验80 植物组织培养
原理
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸和6—苄基氨基腺嘌呤的比例，决定了根和芽的分化。
近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。
Ⅰ ．愈伤组织培养的分化
原理
植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在1957年Skoog即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。
仪器药品
培养室 接种箱或超净工作台
高压灭菌锅 分析天平
水浴锅 长镊子
解剖刀 剪刀
三角烧瓶(100ml) 容量
烧杯 移液管
量筒 牛皮纸
培养皿 称量纸
棉线 HgCl2 （或次氯酸钠）
乙醇 6—苄基氨基腺嘌呤
IAA或2， 4—D MS培养基（见附表16和17）
操作步骤
1．配制培养基
(1)愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L,2,4─D含量为2mg/L,琼脂10g/L）。
(2)试验培养基：按下表配制。
吲哚乙酸用少量0.1mo/L NaOH溶解，6—苄基氨基腺嘌呤用少量0.1mol/L HCl溶解。
2．培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH5.8，趁热分装于100ml三角烧瓶中，每瓶约20ml。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中121℃(1kg/cm2 )下灭菌20分钟。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
3．诱导产生愈伤组织
(1)取健壮的烟草茎数段，每段约5cm长，于烧杯中用0.1%氯化汞（升汞）浸泡20分钟，取出用无菌水洗3─4次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30分钟），用解剖刀切成5mm厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4片，接种后扎好瓶口。
(2)将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25℃温室中，每星期检查1─2次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3─4周后产生愈伤组织。
(3)选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1─2块，仍培养在25℃温室中，每周1─2次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。
