实验26 硝酸还原酶活性的测定

实验26 硝酸还原酶活性的测定

原理

　　硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮

　

　　

　　简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO₂ 。

仪器药品

　　721型分光光度计　　　 真空泵（或注射器）

　　保温箱 　　　　　　　　天平

　　真空干燥器　　　　　　 钻孔器

　　三角烧瓶 　　　　　　　移液管

　　烧杯

　　0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。

　　0.2mol/L KNO₃ ：溶解20.22g KNO₃ 于1000ml蒸馏水中。

　　磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

　　α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

　　NaNO₂ 标准溶液：1g NaNO₂ 用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO₂ 5μg，用时稀释之。

操作步骤

　　1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3─0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸　　注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加

　　保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测

　　3. ．绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

　　吸取不同浓度的NaNO₂ 溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO₂ 浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。