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        土壤微生物分离纯化及测数

        互联网

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        一、实验目的要求
        1 了解土壤微 生物 的分离纯化及测数的基本原理。
        2 学习并掌握微 生物 分离纯化技术方法。
        3 学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。

        二、基本原理
        土壤是微生物生活的大本营,其中含有大量不同类型的微生物,可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养,并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散,单细胞得以生长发育形成菌落,可使用稀释法或平板划线法进一步纯化,还可通过平板菌落计数,推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。

        三、实验步骤
        (一)土壤样品采集
        在待测田块上,若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样,若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0--20cm,先除去表土1--2cm,以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。
        (二)好气性细菌的分离纯化及测数
        1.制备土样稀释液
        吹吸三次混匀
        无菌操作

        另留一管不稀释留作对照(CK)

        2.培养基的准备
        融化牛肉膏 蛋白胨 培养基,融化后保温在48℃。并取6个无菌培养皿,分别在皿底贴好标签,注明10 -5 、10 -6 、CK(每个稀释度要两个平行皿,对照要两个平行皿)。

        3.倾注法接种
        先按10 -6 ,10 -5 的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中(每个平皿接入1ml),再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏 蛋白胨 培养基(48℃)待冷凝,混合均匀。

        4.保温培养
        将已经接种的平皿静置10min后,放入温箱倒置培养3--5日(30℃),观察结果。

        5.分区划线法纯化
        平板划线分离,其划线方法有以下两种:

        6.计数
        要求30~300之间计数。CK除外。

        每克湿土样细菌数量
        =平均菌落数×稀释倍数
        土壤样品水分系数
        =1∕(1—样品水分百分数)
        土壤样品细菌数量(个∕克干土)
        =每克湿土样细菌数量×样品水分系数

        四实验报告及思考题
        1记录计数结果并计算土壤样品含菌数。
        2平板菌落计数的结果是土壤样品实际含菌数?
        3 比较平板菌落计数与显微镜直接计数的异同,它们各有何优缺点

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