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        免疫荧光技术常见问题汇总

        互联网

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        1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白,两者操作过程有哪些不同?

        参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的。

        2、问:近期要做免疫荧光双标,不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?

        参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:

        (1)选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

        (2)我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗4度孵育过夜比较好,背景比较清晰。

        (3)我的阳性对照用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

        (4)封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是10%的正常donkey血清。

        (5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

        3、问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光,二抗为FITC标记,想请教各位大侠:

        (1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?

        (2)封片时是否用甘油缓冲液即可,还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?

        (3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?

        参考见解:

        (1)你的二抗是用FITC标记的,为避免荧光分解,分装及荧光显微镜观察时均要避光;

        (2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液,后者能使玻片透明;

        (3)关于免疫酶染色,如果是用过氧化物酶做标记,就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用,目的是使DNA变性,让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。

        4、问:做间接法免疫荧光染色,如何设置对照?

        参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色。

        (1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化,这个对照必须有,目的是看自发荧光,脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

        (2)阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应。

        (3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应。

        5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色,结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号,阴性对照组也没有荧光,但是拿到荧光显微镜下看,我的阴性对照组一片绿,像非特异性染色,到底哪个结果才是真实的呢?

        参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多,出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题,如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因,荧光显微镜没有问题,那就以共聚焦显微镜的结果为主。

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