流式CBA方法--检测大鼠细胞因子实验方案
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1. 实验所需试剂
1.1 RAT IFN-GMA CBA FLEX SET （558305）
规格：100TST
组成：Rat IFN-γ 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IFN-γ PE 检测二抗试剂，Rat IFN-γ捕捉微球（定位：A6）
1.2 RAT IL-10 CBA FLEX SET （558306）
规格：100TST
组成：Rat IL-10 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-10 PE 检测二抗试剂，Rat IL-10捕捉微球（定位：A8）
1.3 RAT IL-6 CBA FLEX SET （558308）
规格：100TST
组成：Rat IL-6 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-6 PE 检测二抗试剂，Rat IL-6捕捉微球（定位：A9）
1.4 RAT TNF CBA FLEX SET （558309）
规格：100TST
组成：Rat TNF 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat TNF PE 检测二抗试剂，Rat TNF捕捉微球（定位：C8）
1.5 Rat IL-1a Flex Set (560159)
规格：100TST
组成：Rat IL-1a标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-1a PE 检测二抗试剂，Rat IL-1a捕捉微球（定位： A4）
1.6 Rat IL-2 Flex Set (561420)
规格：100TST
组成：Rat IL-2标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-2 PE 检测二抗试剂，Rat IL-2捕捉微球（定位：Bead E5）
1.7 Rat IL-4 Flex Set (558307)
规格：100TST
组成：Rat IL-4标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-4 PE 检测二抗试剂，Rat IL-4捕捉微球（定位：Bead B9）
1.8 BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit(558266)
| Reagent | Quantity(558266) |
| Assay Diluent | 1 bottle, 30 mL |
| Capture Bead Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Detection Reagent Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Wash Buffer | 1 bottle, 130 mL |
| Instrument Setup Bead A1 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead A9 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 1.0 mL |
| Instrument Setup Bead F9 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Positive Control Detector | 1 vial, 0.5 mL |
2. 实验操作步骤：
2.1准备Rat Soluble Protein Flex Set标准品
（Rat Soluble Protein Flex Set标准品为干粉状态，与检测试剂混合前首先应该重新稀释。）
2.1.1 打开即将用于检测对应细胞因子标准品瓶子，将所有干粉转移到15ml流式上样管中，用4ml Assay Diluent溶液稀释重悬，此管标记为TOP Standard，室温静止15min。
2.1.2 然后取9根管子，分别标记为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128和1:256；每根管子加入500ulAssay Diluent稀释液，按照下图依次转移500ul到下一管，完成梯度稀释。
2.1.3 最后取根管标记为0pg/ml，只加入500ulAssay Diluent稀释液。
2.1.4 最终实现如下表格的浓度梯度。
| Dilution tube | |||||||||
| Rat Soluble Proteim Flex Sex | Top Standard | 1:2 | 1: 4 | 1:8 | 1:16 | 1: 32 | 1: 64 | 1:128 | 1:256 |
| Protein (pg/mL) | 10,000 | 5,000 | 2,500 | 1,250 | 625 | 312.5 | 156 | 80 | 40 |
2.2 混合Rat Soluble Protein Flex Set捕捉微球（捕捉微球为50倍浓度保存，使用前应稀释为最佳反应浓度）
2.2.1 按照实验要求，每种微球单次检测母液量为1ul，公式为：总体积=捕捉微球种类数1uundefined检测样本数+（捕捉微球种类数1uundefined检测样本数49）
2.2.2 将稀释好的捕捉微球标记为“Mixed Capture Beads”待用，不能长时间储存。
2.2.3 稀释待测样本：大鼠标准品覆盖范围为40 to 10,000 pg/mL，如果预测待测样本浓度过大，需对其进行稀释。实验者根据样品预测浓度，选择合适的稀释比例，也可以使用多个稀释比例摸索一个最佳稀释量；稀释缓冲液为Assay Diluent。大鼠血清和血浆一般要求稀释4倍以上。
2.3准备大鼠Protein Flex Set检测试剂
大鼠PE检测试剂为50倍浓缩试剂，加入检测管前要确保此时检测试剂终浓度为50稀释，单次反应量为1ul。（注此过程需避光）
公式为：需要加入的Detection Reagent Diluent稀释液=反应次数50ul~F反应次数1ul。
2.4标准品以及样品上机前处理步骤
2.4.1加入50ul大鼠Soluble Protein Flex Set Standard 稀释液到10个流式管里，
| Well label | Standard dilution | Mouse Conc (pg/mL) | Rat Conc (pg/mL) |
| 1 | no standard dilution (Assay Diluent only) |
0 (negative control) |
0 (negative control) |
| 2 | 1:256 | 10 | 40 |
| 3 | 1:158 | 20 | 80 |
| 4 | 1:64 | 40 | 156 |
| 5 | 1:32 | 80 | 312.5 |
| 6 | 1:16 | 156 | 625 |
| 7 | 1:8 | 312.5 | 1,250 |
| 8 | 1:4 | 625 | 2,500 |
| 9 | 1:2 | 1,250 | 5,000 |
| 10 | Top Standard | 2,500 | 10,000 |
2.4.2加入50ul未知样品到分析管里，轻轻混匀捕捉混合微球，吸取50ul加入分析管中，室温孵育1小时。
2.4.3每个待测管中加入PE检测试剂50ul，轻轻震荡混匀。室温孵育2小时。
2.4.4加入1ml清洗液Wash Buffer。200g离心5分钟，去上清。
2.4.5加入300ul清洗液Wash Buffer清洗液，震荡重悬微球。
2.5机器条件设定
BD .FACSCalibur包含488蓝激光和633红激光，可以实现CBA.Flex.Set试剂盒检测，一次最多可以检测30个指标，A4-E9，见下图。
2.5.1 机器设定试剂前处理
2.5.1.1标记5个管子，分别为A-B-C-D-E.
2.5.1.2分别吸取25.µLPE.Instrument.Setup.Bead.F1和50?L of PE Positive Control Detecto 加入D管中；避光室温孵育15分钟。
2.5.1.3吸取25.µLInstrument.Setup.Bead.A9加入A管。
2.5.1.4吸取25.µLInstrument.Setup.Bead.A1加入B管。
2.5.1.5吸取25.µLInstrument.Setup.Bead.F9加入C管。
2.5.1.6吸取25.µLInstrument.Setup.Bead.F1加入A,.B,.C,.and.D管。
2.5.1.7加入50ul捕捉微球到E管。
2.5.1.8加入300ulwash buffer到D管，加入350ul wash buffer到A，B，C，E管。
2.5.2 机器设定上机操作
2.5.2打开软件BD.CellQuestTM并调用.BD?.CBA.Flex.Set.setup.模版。
2.5.2.1设定储存文件位置，并机器定格为获取分析状态。
2.5.2.2设定前向侧向通道为对数放大。
2.5.2.3相对于BD FACSComp的SSC值降低100。
2.5.2.4设定侧向阈值为650。
2.5.2.5Setup状态下，检测A管，调整微球在R1门里。
调整R2门使门内包含了最亮的微球部分。并分别调整FL3和FL4使A9微球中间值分别在1500和5000道数。
调整R3使F1微球在其门里，调整FL2的电压，使F1微球FL2通道的中间值在2.5和4之间。
2.5.2.6上机B管调整FL4-%FL3的补偿
调整R4使其A1细胞在门内；调整R5使F1在其门内。使用FL4-%FL3调整补偿，使G4的中间值和G5的相当。
2.5.2.7上机C管调整FL3-%FL4的补偿
调整FL3-%FL4补偿使R6和R7的中间值相当。
2.5.2.8上机D管调整FL3-%FL2的补偿
调整R8使FL1在其门内，调整R9使PF-F1在其内部；调整FL3-%FL2的补偿，使G8和G9中间值相当。
2.5.2.9上机E管，调整FL2.-.%FL3的补偿
调整R10，R11，R12，R13，.和R14，使每一个微球落在每个门内。调整FL2.-.%FL3的补偿使G10，G11，G12，G13，以及G14的中间值相当。
2.6 数据获取：
1、 打开BDTMCBA.Flex.Set.setup.模版，设定获取分析模式。
2、 在.Acquisition.and.Storage.窗口里选择：
Acquisition.Gate:G1=R1
获取停止时间为30undefined检测微球种类数量，尽量不要超过这个值。
设定分辨率1024
3、
| 货号 | 货名 | 目录价格 |
| 558305 | RAT IFN-GMA CBA FLEX SET 100TST A6 | 3250.00 |
| 558306 | RAT IL-10 CBA FLEX SET 100TST A8 | 3331.00 |
| 558308 | RAT IL-6 CBA FLEX SET 100TST A9 | 5348.00 |
| 558309 | RAT TNF CBA FLEX SET 100TST C8 | 3250.00 |
| 558266 | MS/RAT SOLBL PTEIN CBA FLEX KIT 100TST | 2925.00 |
| 560159 | Rat IL-1a Flex Set (Bead A4) | 3500 |
| 561420 | Rat IL-2 Flex Set (Bead E5) | 4300 |
| 558307 | Rat IL-4 Flex Set (Bead B9) | 5014 |
