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        苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定

        互联网

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        一、原理

        苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)催化苯丙氨酸的脱氨反应,使NH3释放出来形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起重要作用。根据其产物,反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

        二、材料、仪器设备及试剂

        (一)材料:马铃薯块茎

        (二)仪器设备:1. 紫外分光光度计;2. 离心机;3. 研钵;4. 吸滤瓶;5. 红光装置;6. 打孔器。

        (三)试剂:1. 0.05mol/L 硼酸盐缓冲溶液(pH8.8);2. 0.02mol/L 苯丙氨酸(用0.1mol/L pH8.8硼酸缓冲液配制);3. 5mmol/L 巯基乙醇硼酸缓冲液。

        三、实验步骤

        1. 马铃薯圆片制备 将马铃薯块茎洗净、削皮,用打孔器(直径1.5cm)取圆柱,切除两头近表皮处,中间部分切成2mm厚的圆片。先用自来水漂洗,最后用蒸馏水洗一次,用纱布吸干表面的水。

        2. 光诱导 将圆片平铺在湿润滤纸的培养皿中,置20~30℃红光下处理24h以诱导PAL(也可接种病原菌诱导等)。

        3. 酶粗提液的制备 经诱导处理的马铃薯圆片5g,加10ml含5mmol/L 的巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或PolyclarAT(除去酚类物质毒害,防止颜色的干扰、少量石英砂在研钵中研磨。匀浆抽气过滤,滤液10,000rpm离心15min,上清液为酶粗提液。上述操作均在0~4℃下进行。

        4. 活性测定与计算 1ml酶液加1ml0.02mol/L 苯丙氨酸,2ml蒸馏水,总体积为4ml。对照不加底物,多加1ml蒸馏水;反应液置恒温水浴30℃中保温,0.5h后用紫外分光光度计在290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度变化0.01所需酶量为一单位(相当每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸)。蛋白质含量用Folin-酚法进行测定。

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