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        常用的免疫酶染色方法

        丁香园

        10259

        常用的免疫酶染色方法

        分为以下两种方法:

        (一)酶标抗体法

        ~undefined直接法

        ~undefined间接法

        (二)非标记抗体酶法

        ~undefined酶桥法

        ~undefinedPAP法

        (一)酶标抗体法

        ~undefined通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,与标本进行反应后,再用酶组化法将酶显色,使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。

        -优点:切片能长期保存、反复观察,适于镜下半定量分析。

        -缺点:酶与抗体形成的共价键,可损害抗体和酶的活性;易产生非特异染色。

        (1) 酶标抗体法——直接法

        将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。

        (2) 酶标抗体法——间接法

        ~undefined将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。

        (a) 酶标抗体间接法的操作步骤

        ~undefined标本准备:

        -石蜡脱蜡至水;

        -冰冻切片浸入4°C丙酮固定10min,0.01M PBST漂洗,5min×3;

        -细胞爬片先用PBS洗,然后4°C丙酮固定10min,再0.01M PBST漂洗,5min×3;

        ~undefined石蜡切片需要进行抗原修复,其它标本则不用;

        ~undefined封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5~10min (湿盒内) ;

        ~undefined0.01M PBST漂洗,5min×3;

        ~undefined5~10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭,室温孵育30min (湿盒内) ;

        ~undefined倾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗, 37°C孵育60min 或4°C过夜(湿盒内);

        ~undefined0.01M PBST 漂洗,5min×3;

        ~undefined加HRP 标记的二抗室温孵育lh或37°C 30min ;

        ~undefined加0.01%H2O2~0.05%DAB显色 (显色液应新鲜配置);

        ~undefined经PBS漂洗3次后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,明胶甘油封片,显微镜观察。

        (二)非标记抗体酶法

        酶桥法

        ~undefined首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体;

        ~undefined以二抗作桥,将抗酶抗体联结在一抗上;

        ~undefined再将酶结合在抗酶抗体上,经显色显示抗原的分布

        -优点:任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害,提高了方法的敏感性,而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。

        几点说明

        ~undefined一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些,使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。

        ~undefined二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量,使其Fab段一个与一抗结合,另一个则游离。

        ~undefined因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG,具有相同的抗原性,所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合,起桥作用,将其连接在与组织抗原结合的一抗上。

        PAP法

        ~undefined 与酶桥法相似,不同的是,PAP 法将酶桥法的第 3、4 步并为1步,用PAP复合物代替。

        ~undefinedPAP是离体制备的复合物( HRP--抗 HRP)。

        ~undefined显色与酶桥法相同,PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解,形成不溶性终产物。

        PAP法评价

        ~undefinedPAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。

        -缺点:步骤较多,时间较长,不适用于临床常规检查。

        ~undefined由于常做石蜡切片,故可用于回顾性研究。

        (二) 亲和组织化学法

        ~undefined是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。

        ~undefined这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。

        想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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