• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        DNA 序列分析技术

        互联网

        6786

        2.4 干胶制备和压片

        电泳结束后取下胶板,用工具撬开玻璃板,使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧,使胶粘在滤纸上,然后将胶放置于干胶器中制备干胶1~1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中,放于暗室中,将X 光片压于胶上曝光2~3 天。

        2.5 X 光片的冲洗

        将曝光后的X 光片显影4~8 分钟(根据显影液的使用时间长短而定);定影5~10 分钟,冲洗后即可读取DNA 序列。

        3 自动 DNA 序列分析技术

        本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit(#401434)或FS-DNA Sequencing Kit(#402079)进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。

        3.1 混合反应物

        (1)取2.5μl 纯化好的PCR 产物[相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf(+)DNA],进行琼脂糖凝胶电泳。

        (2)凝胶用溴化乙锭染色,用流水冲洗脱色后,在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf

        (十)DNA 估测待测DNA 模板的浓度,以确定测序反应中应取的模板量。

        (3)在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中,混合以下反应物:

        DNA 模板 适量
        引物(10pmol/ml) 0.5μl
        加水至 5.25μl 或6.0μl(FSKit)
        100℃下变性2 分钟,再冰浴2 分钟后短暂离心,然后加:
        DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl
        或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl
        终体积 10μl

        (4)用微量取样器将反应物充分混合后,加 20μl 石蜡油覆盖。

        3.2 热循环反应

        该反应中降温时间非常关键(约1℃/s)。因此,可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪(PCR 仪,如 480,2400 或 9600)。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中,按以下程序进行热循环反应:

        (1)96℃ 1 秒钟
        96℃ 30 秒钟

        (2)50℃ 1 秒钟

        50℃ 1 分钟

        (3)60℃ l 秒钟
        60℃ 4 分钟

        共需25 个循环。

        3.3 纯化测序产物

        纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱(#CS-901)。操作过程如下:

        (1)轻弹柱,使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。

        (2)移去柱上盖,加入 800μl 去离子水,再盖上盖振荡,以除去气泡。

        (3)在室温下放置30 分钟,以水化凝胶柱。

        (4)移去柱上盖和下盖,将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中,让多余液体流出。

        (5)倒去液体,将柱连同洗脱管一起在 3 000r/min 下离心 2 分钟。

        (6)将柱放入一个1.5ml 离心管中,用微量取样器将测序反应物取出,注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。

        (7)3 000r/min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。

        (8)将样品放在真空干燥离心机中干燥。

        (9)将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。

        应注意的是,Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后,要用自来水洗3 次,蒸馏水洗 2 次,然后倒置于一试管架上晾干后,称取 50mg Cephadex G-50(Sigma,#9048719)放入其中,即可再行使用。

        3.4 电泳

        使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳,并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。

        (1)聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25%,配制过程如下:

        尿素 18g
        Amberlite 离子交换树脂(Sigma,MB-lA) 约39g
        40%Acry mide:Bis(19:1 )(AMRESCO,#0496-500) 5.3ml
        去离子水 25ml
        将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。

        (2)取5ml 10 倍TBE,通过2μm 滤膜抽滤后,再抽滤以上胶液。
        10 倍TBE 配方:
        Tris-base 108g
        硼酸 55g
        Na2 EDTA(2H2O) 7.44g
        定容至 1L

        (3)将滤过液定容至 50ml,加入 35μl TEMED 和 250μl 10%过硫酸胺(APS),轻摇混合后,用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中

        (4)1 小时后,将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟,恒压1kv,并使温度升至 51℃。

        (5)预电泳的同时,取出 36 份―70℃下贮存的样品,各加入5μl 载样液(50μl 试剂盒中配备的loading buffer+250μl 去离子甲酰胺,临用前配制)。

        (6)将混合液在旋涡混合器上振荡,94℃下变性2 分钟,冰浴2 分钟后短暂离心。

        (7)各取 1.5μl 点样,恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况,此时应人为修复。


        2.4 干胶制备和压片
        电泳结束后取下胶板,用工具撬开玻璃板,使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧,使胶粘在滤纸上,然后将胶放置于干胶器中制备干胶1~1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中,放于暗室中,将X 光片压于胶上曝光2~3 天。

        2.5 X 光片的冲洗
        将曝光后的X 光片显影4~8 分钟(根据显影液的使用时间长短而定);定影5~10 分钟,冲洗后即可读取DNA 序列。

        3 自动 DNA 序列分析技术

        本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit(#401434)或FS-DNA Sequencing Kit(#402079)进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。

        3.1 混合反应物
        (1)取2.5μl 纯化好的PCR 产物[相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf(+)DNA],进行琼脂糖凝胶电泳。
        (2)凝胶用溴化乙锭染色,用流水冲洗脱色后,在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf
        (十)DNA 估测待测DNA 模板的浓度,以确定测序反应中应取的模板量。
        (3)在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中,混合以下反应物:
        DNA 模板 适量
        引物(10pmol/ml) 0.5μl
        加水至 5.25μl 或6.0μl(FSKit)
        100℃下变性2 分钟,再冰浴2 分钟后短暂离心,然后加:
        DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl
        或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl
        终体积 10μl
        (4)用微量取样器将反应物充分混合后,加 20μl 石蜡油覆盖。

        3.2 热循环反应
        该反应中降温时间非常关键(约1℃/s)。因此,可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪(PCR 仪,如 480,2400 或 9600)。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中,按以下程序进行热循环反应:
        (1)96℃ 1 秒钟
        96℃ 30 秒钟
        (2)50℃ 1 秒钟
        50℃ 1 分钟
        (3)60℃ l 秒钟
        60℃ 4 分钟
        共需25 个循环。

        3.3 纯化测序产物
        纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱(#CS-901)。操作过程如下:
        (1)轻弹柱,使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。
        (2)移去柱上盖,加入 800μl 去离子水,再盖上盖振荡,以除去气泡。
        (3)在室温下放置30 分钟,以水化凝胶柱。
        (4)移去柱上盖和下盖,将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中,让多余液体流出。
        (5)倒去液体,将柱连同洗脱管一起在 3 000r/min 下离心 2 分钟。
        (6)将柱放入一个1.5ml 离心管中,用微量取样器将测序反应物取出,注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。
        (7)3 000r/min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。
        (8)将样品放在真空干燥离心机中干燥。
        (9)将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。
        应注意的是,Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后,要用自来水洗3 次,蒸馏水洗 2 次,然后倒置于一试管架上晾干后,称取 50mg Cephadex G-50(Sigma,#9048719)放入其中,即可再行使用。

        3.4 电泳
        使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳,并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。
        (1)聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25%,配制过程如下:
        尿素 18g
        Amberlite 离子交换树脂(Sigma,MB-lA) 约39g
        40%Acry mide:Bis(19:1 )(AMRESCO,#0496-500) 5.3ml
        去离子水 25ml
        将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。
        (2)取5ml 10 倍TBE,通过2μm 滤膜抽滤后,再抽滤以上胶液。
        10 倍TBE 配方:
        Tris-base 108g
        硼酸 55g
        Na2 EDTA(2H2O) 7.44g
        定容至 1L
        (3)将滤过液定容至 50ml,加入 35μl TEMED 和 250μl 10%过硫酸胺(APS),轻摇混合后,用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中。
        (4)1 小时后,将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟,恒压1kv,并使温度升至 51℃。
        (5)预电泳的同时,取出 36 份―70℃下贮存的样品,各加入5μl 载样液(50μl 试剂盒中配备的loading buffer+250μl 去离子甲酰胺,临用前配制)。
        (6)将混合液在旋涡混合器上振荡,94℃下变性2 分钟,冰浴2 分钟后短暂离心。
        (7)各取 1.5μl 点样,恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况,此时应人为修复。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序